The Role of HPV16 E1 in Cervical Carcinogenesis

บทบาทของโปรตีน E1 ของไวรัสแปปิโลมาทัยป์ 16 ในการก่อมะเร็งปากมดลูก

Name: Fern Baedyananda

keyword: Papillomaviruses

; Cervix uteri Cancer

; Gene expression

Abstract: Objectives: This study aimed to determine the expression profile of HPV-16 E1 in cervical samples and the role of E1 in cervical carcinogenesis. In addition, this work also aimed to determine whether the HPV-16 E1 63bp duplication is present in the Thai population.Methods: One-hundred and twenty-four HPV16 positive cervical samples ranging from normal, CIN1, CIN2/3, and SCC lesions were studied. E1 mRNA expression was determined by ddPCR. Methylation of promoters p97 and p670 was quantified by pyrosequencing, while PCR and sequencing were used to determine the physical state and variations of HPV16 E1 genome. HEK 293T cells were transfected with pEGFP-C1 containing HPV16 E1. Cell proliferation of transfected cells was measured using cell viability count and cell metabolism assay. Apoptosis and necrosis was determined in transfected cells treated with or without QVD-OPH (pan-caspase inhibitor) by Annexin V and propidium iodide staining and quantitated using flow cytometry. RNA expression Microarray analysis was performed on FACS sorted HPV16 transfected cells. RNA expression was confirmed by Real-time reverse transcription (RT) PCR. Plasmid containing pEGFP-C1 was used as a vector control throughout the experiments.Results: Increased E1mRNA expression related to disease progression (normal 0.18, CIN 1 0.41, CIN 2/3 0.65 and SCC 0.79) was demonstrated with significant positive correlation (r = 0.661, p =0.019). No association between physical state and E1 expression was found. Methylation of p97and p670 promoters showed significant elevation in SCC compared to normal samples. Only 4.2% showed genomic variations of HPV16 E1 63 bp duplication. HPV16 E1 transfected HEK293T cells showed a significant decrease in number of viable cells and cell proliferation 24 h post-transfection (p < 0.0001). HPV16 E1 significantly induced both apoptotic and necrotic cell death 48 h post-transfection. Treatment of HPV16 E1 transfected cells with QVD-OPH showed a decreasing trend without statistical significance. Microarray and real-time RT PCR results revealed that E1 dysregulated genes involved in protein synthesis (RPL36A), metabolism (ALDOC), cell proliferation (CREB5, HIF 1A, JMJD1C, FOXO3, NFKB1, PIK3CA, TSC22D3), DNA damage (ATR, BRCA1 and CHEK1), and immune response (ISG20) pathways. Kinetic host gene expression in HPV16 E1 transfected cells indicated that most genes were downregulated after 48 h post-transfection.Conclusion: Detection of E1 mRNA and p97 methylation were beneficial as cancer prognostic markers. The presence of 63 bp duplication in HPV16 E1 was observed in the Thai population and related to low grade lesions. The presence of HPV16 E1 protein alone was able to dysregulate many cellular pathways in a time dependent manner. Notable genes disrupted by HPV16 E1 included genes involved in cell proliferation and host DNA damage response. This study suggests that E1 may play a role in cancer development however HPV16 E1 transfection experiments did not provide a definite carcinogenic pathway which warrants further studies.

Abstract: วัตถุประสงค์ การศึกษานี้มีเป้าหมายในการหารูปแบบการแสดงออกของยีน E1 ของไวรัสแปปิโลมาไทป์ 16 ในตัวอย่างเซลล์ปากมดลูก และบทบาทของโปรตีน E1 ในการก่อมะเร็งปากมดลูก นอกจากนี้งานนี้ยังมีเป้าหมายในการตรวจหาการซ้ำของ ยีน E1 ของไวรัสแปปิโลมาไทป์ 16 ขนาด 63 คู่เบสในประชากรไทยด้วยวิธีทำ การศึกษานี้ใช้ตัวอย่างเซลล์ปากมดลูกที่มีไวรัสแปปิโลมาไทป์ 16 แบ่งเป็นเซลล์ปกติ เซลล์ผิดปกติระยะก่อนมะเร็ง (CIN) 1, 2/3 และ ระยะมะเร็ง (SCC) รวม 124 ตัวอย่าง วัดปริมาณการแสดงออกของ E1mRNA ด้วยวิธี ddPCR ศึกษาภาวะเมธิลเลชั่น ของโปรโมเตอร์ p97 และ p 670 ด้วยวิธี pyrosequencing ศึกษาลักษณะรูปแบบของสารพันธุกรรมและความเปลี่ยนแปลงของยีน E1 ด้วยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ศึกษาคุณสมบัติของโปรตีน E1 ด้วยการนำพลาสมิดที่มียีน E1 (pEGFP-C1-HPV16 E1) เข้าในเซลล์ HEK293T หลังจากนั้นทำการศึกษาการเจริญเพิ่มจำนวนของเซลล์ โดยนับปริมาณเซลล์ที่มีชีวิตและตรวจการทำงานของเซลล์ ศึกษาการตายของเซลล์แบบ apoptosis และ necrosis ด้วยการย้อมด้วย Annexin V และ propidium iodine ในภาวะที่มีและไม่มีสารยับยั้ง caspase (QVD-OPH) และนับปริมาณเซลล์ด้วยการใช้เครื่อง flow cytometry ศึกษาการแสดงออกของ RNA ภายในเซลล์ที่มีการแสดงออกของโปรตีน E1 ด้วยวิธี microarray และยืนยันการแสดงออกของ RNA ด้วยวีธี Real-time reverse transcription (RT) PCR ใช้พลาสมิด pEGFP-C1 เป็นตัวควบคุมและเปรียบเทียบตลอดการศึกษานี้ผลการทดลอง มีการเพิ่มขึ้นของปริมาณ E1mRNA สัมพันธ์เป็นเส้นตรงกับการพัฒนาของโรค (เซลล์ปกติ 0.18, CIN 1 0.41, CIN 2/3 0.65 และ SCC 0.79) อย่างมีนัยสำคัญ (r = 0.661, p =0.019) ไม่พบว่ามีความเกี่ยวข้องระหว่างลักษณะรูปแบบของสารพันธุกรรมกับการแสดงออกของ E1mRNA พบภาวะเมธิลเลชั่นของโปรโมเตอร์ p97 และ p 670 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างเซลล์มะเร็งเมื่อเปรียบเทียบกับตัวอย่างเซลล์ปกติ และพบว่ามีความเปลี่ยนแปลงของยีน E1 ที่มีการซ้ำของ 63 คู่เบสเพียงร้อยละ 4.2 จากการนับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตและติดตามการเจริญเติบโตของเซลล์ HEK293T ที่มีการแสดงออกของโปรตีน E1 พบว่าเซลล์มีจำนวนลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ 24 ชั่วโมงหลังการนำเข้าพลาสมิด เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ที่มีพลาสมิดตัวควบคุม (p < 0.0001) และยังพบว่าโปรตีน E1 เหนี่ยวนำให้เซลล์ตายด้วยกระบวนการของ apoptosis และ necrosis ที่ 48 ชั่วโมงภายหลังการนำเข้าพลาสมิด เมื่อใส่สาร QVD-OPH พบว่าเซลล์ตายลดลงแต่ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ เมื่อศึกษาการแสดงออกของ RNA ภายในเซลล์ที่มีการแสดงออกของโปรตีน E1 ด้วยวิธี microarray และยืนยันการแสดงออกของ RNA ด้วยวีธี Real-time reverse transcription (RT) PCR พบว่าโปรตีน E1 มีผลเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของยีนหลายชนิดที่เกี่ยวข้องกับวิถีการสร้างโปรตีน (RPL36A) กลไกเมตะบอลิซึม (ALDOC) การเพิ่มจำนวนของเซลล์ (CREB5, HIF 1A, JMJD1C, FOXO3, NFKB1, PIK3CA, TSC22D3) การแตกหักของดีเอ็นเอ (ATR, BRCA1 และ CHEK1), และการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน (ISG20) อัตราการแสดงออกของยีนส่วนใหญ่ในเซลล์โฮสท์ที่มีการแสดงออกของโปรตีน E1 จะลดลงที่ 48 ชั่วโมงภายหลังการนำเข้าพลาสมิดสรุป การตรวจหา E1mRNA และภาวะเมธิลเลชั่นของโปรโมเตอร์ p97 มีประโยชน์เป็นตัวบ่งชี้เพื่อพยากรณ์การเกิดมะเร็ง การมียีน E1 ซ้ำของ 63 คู่เบสในประชากรไทยพบสัมพันธ์กับรอยโรคระยะก่อนมะเร็ง โปรตีน E1 ของไวรัสแปปิโลมาไทป์ 16 สามารถเปลี่ยนแปลงวิถีสัญญาณภายในเซลล์หลายวิถีและขึ้นกับระยะเวลาที่แสดงออกของโปรตีน E1 ยีนที่ได้รับผลกระทบนี้เกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวนของเซลล์และการตอบสนองต่อการแตกหักดีเอ็นเอของเซลล์โฮสท์ การศึกษานี้เสนอว่าโปรตีน E1 น่าจะมีบทบาทในการพัฒนาเซลล์กลายเป็นมะเร็ง อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของโปรตีน E1 ภายในเซลล์ ในการศึกษานี้ไม่สามารถระบุวิถีที่จำเพาะเกี่ยวกับกลไกการเกิดมะเร็งได้ ซึ่งต้องมีการศึกษาต่อไป

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Parvapan Bhattarakosol

Role: advisor

Created: 2018

Modified: 2026-06-19

Issued: 2026-06-19

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

DOI: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/69419

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biomedical Sciences and Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5674851930.pdf	6.12 MB

ใช้เวลา

-0.979753 วินาที