การส่งถ่ายยืน (CCC1) เข้าสู่ต้นบุก (Amorphophallus paeonifolius (Dennst.) Nicolson) ด้วยเทคนิค Agrobacterium - MEDIATED TRANSFORMATION

Genetic transformation of gene (CCC1) into konjac Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson) BY Agrobacterium - Mediated transformation technique

Name: วาสนา มณีจันทร์

keyword: การโคลน

; การเพาะเลี้ยงเนื้่อเยื่อ

; บุก (พืช)

; การส่งถ่ายยืน

; ต้นบุก

Abstract: การปนเปื้อนของโลหะหนักในสิ่งแวดล้อมเป็นปัญหาสำคัญ ในงานวิจัยนี้ได้มุ่งเน้นศึกษาการส่งถ่ายยีนที่เกี่ยวข้องกับการดูดซับโลหะหนักเข้าสู่ Retarded shoots ด้วยเชื้อ Agrobacterium tumefaciens โดยขั้นตอนของการส่งถ่ายยีนจะต้องอาศัยเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อร่วมด้วยเพื่อชักนำให้เกิดเป็นต้นที่สมบูรณ์ ในการชักนำให้เกิด Retarded shoots จะนำชิ้นส่วนลำต้นอ่อนของบุกมาเพาะเลี้ยงบนสูตรอาหาร Murashige and Skoog (MS) ที่เติม N6-benzyladenine (BA) ความเข้มข้น 0, 1, 2, 3 และ 4 มิลลิกรัมต่อลิตร พบว่า สูตรอาหาร MS ที่เติม BA ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำให้เกิดยอดได้ดีที่สุด จำนวนยอดเฉลี่ย 4.6 ยอดต่อชิ้นส่วนพืช เมื่อนำ Retarded shoots มาทดสอบบนอาหาร MS ที่เติมสารปฏิชีวนะกานามัยซิน ความเข้มข้น 0–100 มิลลิกรัมต่อลิตร พบว่า ความเข้มข้นของสารปฏิชีวนะกานามัยซินที่ 50 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นระดับที่ต่ำสุดที่สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของ Retarded shoots โดยเนื้อเยื่อที่ถูกยับยั้งจะกลายเป็นสีขาวและน้ำตาลทั้งหมด และทดสอบบนอาหาร MS ที่เติมสารปฏิชีวนะเซฟโฟแทกซิม ความเข้มข้น 0–300 มิลลิกรัมต่อลิตร พบว่า ความเข้มข้นสูงสุดที่ Retarded shoots สามารถเจริญเติบโตได้บนอาหารที่เติมปฏิชีวนะเซฟโฟแทกซิม คือ 250 มิลลิกรัมต่อลิตร การศึกษาการส่งถ่ายพลาสมิด pStart โดยใช้เชื้อ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ LBA4404 ที่มียีน nptII เป็นยีนคัดเลือก และยีน gus เป็นยีนรายงานผล เข้าสู่เนื้อเยื่อ Retarded shoots ของบุก พบว่ามีเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตบนอาหารคัดเลือก 11 เปอร์เซ็นต์ และตรวจสอบการแสดงออกของยีน gus ด้วยวิธี GUS assay พบว่า เนื้อเยื่อ Retarded shoots ของบุกเกิดสีน้ำเงิน และมีประสิทธิภาพในการส่งถ่ายยีน 11 เปอร์เซ็นต์ ในการศึกษาทดลองการส่งถ่ายยีน CCC1 เข้าสู่ Retarded shoots ของบุก โดยใช้แบคทีเรีย A. tumefaciens สายพันธุ์ LBA4404 ที่บรรจุ pStart-CCC1 นำ Retarded shoots แช่ในสารละลายแขวนลอยอะโกรแบคทีเรียม เป็นเวลา 30 นาที แล้วเลี้ยง Retarded shoots ร่วมกับแบคทีเรียในที่มืด เป็นเวลา 2 วัน แล้วย้าย Retarded shoots ไปบนอาหารคัดเลือกที่เติมสารปฏิชีวนะกานามัยซิน ความเข้มข้น 50 มิลลิกรัมต่อลิตร และเซฟโฟแทกซิม ความเข้มข้น 250 มิลลิกรัมต่อลิตร ทำการย้าย Retarded shoots ไปยังอาหารเดิมทุก ๆ สองสัปดาห์ เป็นเวลา 6 สัปดาห์ พบว่าเนื้อเยื่อ Retarded shoots มีเปอร์เซ็นต์การรอดชีวิตบนอาหารคัดเลือกของ pStart-CCC1 10 เปอร์เซ็นต์ ในการตรวจสอบการส่งถ่ายยีน CCC1 ด้วยวิธี PCR และ RT-PCR พบว่ามียีนของ CCC1 แทรกอยู่ในต้นอ่อนบุกดัดแปลงพันธุกรรม

Abstract: Contamination from heavy metals is one of the most significant environmental pollutions worldwide. In this research, we have focused on modification of plant by Agrobocterium tumefaciens-mediated genetic transformation of gene involved in metal accumulation. In the process of gene transformation, plant tissue culture technique is required to develop the completed shoots. Retarded shoots were cultured on MS medium supplemented with N6 - benzyladenine (BA) at concentrations of 0, 1, 2, 3 and 4 mg/l. The result showed that MS medium with concentration of 1 mg/l BA was the optimal concentration that was given the mean number of shoot at 4.6 shoot per explants. When retarded shoots were tested on MS medium supplement with kanamycin (0-100 me/L), 50 mg/L kanamycin was the lowest concentration that could inhibit the growth of retarded shoots. All inhibited tissues turned white and brown. When retarded shoots were tested on MS medium supplement with cefotaxium (0-300 mg/L), 250 mg/L cefotaxime was the highest concentration that could promote the growth of retarded shoots. The aim of this study was to transform pStart containing nptil (kanamycin resistance) and gus (reporter gene) gene into chromosomal DNA of retarded shoots of Konjac by A. tumefociencs strain LBA4404. The results showed that the viability of transformed plant on selection medium for pStart was 11 %. The expression of gus gene was confirmed by histochemical GUS assay. It was noted blue color in retarded shoots of Konjac and the transformation frequency was 11 %. The transformation of CCCI gene by retarded shoots of Konjac using A tumefaciens-mediated genetic transformation. A tumefaciens strain LBA4404 harboring pStart-CCCI was successful. The retarded shoots were immersed in the Agrobacterium suspension for 30 min by using co-cultivated system for two days in darkness. After which they were transferred to the selection medium containing antibiotics at concentration 50 mg/l kanamycin and 250 mg/l cefotaxime. Subculturing was done every two weeks for six weeks. The results showed that the survival percentage on selection medium for pStart-CCC1 was 10 96 respectively. The integration of the CCC1 gene were confirmed by PCR and RT-PCR which indicated the integration of gene in transgenic retarded shoots of Konjac.

มหาวิทยาลัยแม่โจ้. สำนักหอสมุด

Address: เชียงใหม่

Email: mjudc@mju.ac.th

Name: รัฐพร จันทร์เดช

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาหลัก

Name: ปวีณา ภูมิสุทธาผล

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาร่วม

Name: ยุวลี อันพาพรม

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาร่วม

Created: 2019

Modified: 2568-10-12

Issued: 2568-08-14

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

Th

tha

DegreeName: ปริญญาวิทยาศาสตรมหาบัณฑิต สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ

Level: Master's Degree

Descipline: Master of Science in Biotechnology

Grantor: Maejo University

©copyrights มหาวิทยาลัยแม่โจ้

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	fulltext.pdf.PDF	3.81 MB

ใช้เวลา

0.034978 วินาที