Development of a simple HPLC method for determination of urinary O-Aminohippuric Acid (OAH) and an Establishment of OAH reference interval

การพัฒนาวิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงอย่างง่ายสำหรับตรวจกรดโอ-อะมิโนฮิพพิวริกในปัสสาวะ และการหาค่าอ้างอิงของกรดโอ-อะมิโนฮิพพิวริก

Name: Shoon Lae Maw

LCSH: O-Aminohippuric Acid (OAH)

LCSH: Urine

ThaSH: Urine -- Examination

Abstract: O-aminohippuric acid (OAH) is considered as a low-abundance urinary fluorescent metabolite with potential as an innovative lung cancer biomarker. A recent method for measuring OAH is high-performance liquid chromatography (HPLC) – mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. These methods are laborintensive and expensive for routine measurement. Thus, a simple method for the determination of urinary OAH is needed. The amount of urinary OAH needs to be normalized by urinary creatinine which is produced at a constant rate. The newly developed method must be able to determine urinary creatinine and OAH in the same run. This work aimed to develop and validate a simple analytical HPLC method for urinary OAH measurement and to establish the reference intervals of OAH in healthy individuals. Moreover, the standard OAH was synthesized in our laboratory. Analysis was performed on a reverse-phase C18 (150 x 4.6 mm, 5 µm) column with a gradient elution system consisting of ammonium acetate buffer (pH 6.5, 100 mM) (A) and acetonitrile (B). Total run time was 27 minutes including equilibration time with 1 mL/min constant flow rate. The column temperature was maintained at 40°C and the sample injection volume was 10 µL. The quantification of both analytes was performed at the same time using a diode array detector (DAD) with a detection wavelength of 235 nm for creatinine and a fluorescent detector (FLD) with a detection wavelength at excitation 340 nm, emission of 430 nm for OAH. After the implementation of optimal conditions, the procedure was compiled according to ICH validation parameters. The obtained linear ranges of the calibration curves were 0.1 – 1000 µg/mL for creatinine and 0.1 – 100 µg/mL for OAH. The recoveries ranged between 91.35 % and 109.12%. The relative standard deviations (RSDs) for the intra-day and inter-day results ranged from 0.11 – 0.66 % to 0.16 – 1.73 %, respectively. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 0.258 µg/mL and 0.783 µg/mL for creatinine while LOD and LOQ for OAH were 0.045 µg/mL and 0.137 µg/mL, respectively. The method was successfully applied to establish reference intervals of OAH in healthy individuals and was defined 0.420 – 2.287 mmol/mol creatinine. Increasing urinary levels of OAH metabolite displayed a weak positive association with age (r = 0.347, p = 0.000) and higher values were found in elder-aged group (over 60 years). However, OAH itself did not depend on smoking status (r = -0.142, p = 0.123). According to those various validate parameters: the proposed method was proved to be able to quantify urinary OAH and creatinine in a single run. It can also be analyzed non-invasively without additional sample processing. Reported herein is the first establishment of OAH reference intervals in healthy individuals and may be benefit to the utilization of OAH as a non-invasive biomarker for lung cancer detection in the future.

Abstract: กรดโอ-อะมิโน ฮิพพิวริก (OAH) เป็นเมตาโบไลด์ในปัสสาวะที่มีคุณสมบัติเรืองแสงฟลูอออเรสเซนต์ได้ จัดเป็นตัวบ่งขึ้ชนิดใหม่ของโรคมะเร็งปอด ปัจจุบันวิธีที่ใช้ตรวจวัด OAH คือ HPLC-MSและ NTIR ซึ่งเป็นวิธีที่ยุ่งยากและมีราคาแพง ไม่เหมาะกับการตรวจในงานประจำวัน ดังนั้นจึงมีความจำเป็นต้องมีการพัฒนาวิธีที่ง่ายในการตรวจ OAH ในปัสสาวะ ในการตรวจวัด OAH ในปัสสาวะจำเป็นต้องเทียบค่ากับ creatinine ดังนั้นวิธีการที่พัฒนาขึ้นนี้ต้องสามารถตรวจวัด OAH และ creatinine ได้พร้อมกัน การศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการตรวจวัด OAH ในปัสสาวะด้วยวิธี HPLC และหาค่าค้าอ้างอิงของ OAH ในปัสสาวะของคนปกติ นอกจากนี้การศึกษาครั้งนี้ยังทำการสังเคราะห์สารมาตรฐาน OAH ขึ้นมาเองอีกด้วย การตรวจวัด OAH ทำโดยใช้คอลัมน์ชนิด C18(150 x 4.6 mm, 5 pm) วิเคราะห์ด้วยระ บบ gradient elution โดยใช้บัฟเฟอร์ 2 ชนิดคือ A: ammonium acetate buffer (pH 6.5, 100 mM) was B: acetomitile ใช้เวลาในการวิเคราะห์ทั้งหมด 27 นาที รวมเวลาในการปรับสมดุลคอลัมน์ อัตราการไหล 1 มล./นาที อุณภูมิในการวิเคราะห์คือ 40 C โดยใช้ตัวอย่างในการวิเคราะห์ 10 ไมโครลิตร detector ที่ใช้มี 2 ชนิดคือ diode array detector (DAD) ที่ความยาวคลื่น 235 mm สำหรับตรวจวัด creatinine และ fluorescent detector (FLD) in excition 340 mm เเละ emission 430 nm สำหรับตรวจวัด OAH หลังจากได้สภาวะที่เหมาะสมแล้ว ทำการตรวจสอบความใช้ได้ของวิธีที่พัฒนาขึ้นตามเกณฑ์ของ ICH ผลพบว่าวิธีที่พัฒนาขึ้นมีความเป็นเส้นตรงในการวิเคราะห์ creatinine อยู่ที่ 0.1 - 1000 ug/mL และของ OAH อยู่ที่ 0.1 - 100 μg/mL ร้อยละการคืนกลับ (% recovery) อยู่ในช่วง 91.35 - 109.12% การตรวจสอบความเที่ยงตรง พบว่ามีค่าร้อยละส่วนเบื่องเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (%RSD) ในวัน เดียวกัน และต่างวันกัน เท่ากับ 0.11 – 0.66 % และ 0.16 – 1.73% ตามสำคับ ค่า limits of detection (LOD) และ limit of quantification (LOQ) ของการตรวจวัด creatinine เท่ากับ 0.258 μg/mL เเละ0.783 μg/mL ตามลำดับ ค่า LOD และ LOQ ของการตรวจวัด OAH มีค่า 0.045 และ 0.137 μg/mL. ตามลำดับ เมื่อใช้วิธีการที่พัฒนาขึ้นตรวจวัด OAH ในปัสสาวะของคนปกติ ได้ค่าอ้างอิงเท่ากับ 0.420– 2.287 mmol/mol creatinine โดยพบว่าระดับของ OAH มีความสัมพันธ์เชิงบวกเล็กน้อยกับอายุ (r = 0.347, p = 0.000) โดยพบว่าผู้สูงอายุ (60 ปีขึ้นไป) จะมีค่า OAH สูงกว่า อย่างไรก็ตามพบว่า OAH ไม่มีความสัมพันธ์กับการสูบบุหรี่ (r = -0.142, p = 0.123) ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าวิธีที่พัฒนาขึ้นมีความเหมาะสมในการวิเคราะห์ OAH และ creatinine ในปัสสาวะ โดยไม่ต้องมีการเตรียมตัวอย่างที่ยุ่งยาก การศึกษานี้เป็นการศึกษาแรกที่รายงานค่าอ้างอิงของ OAH ในปัตสาวะที่ตรวจวัดด้วยวิธี HPLC อย่างง่าย ซึ่งเป็นประโยชน์ในการนำ OAH ไปใช้เป็นตัวบ่งชี้ที่ไม่รุกรานเพื่อตรวจหามะเร็งปอดในอนาคต

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Khanittha Punturee

Role: Advisor

Created: 2024

Modified: 2025-02-08

Issued: 2025-02-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Medical Technology

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	641135801pdf.pdf	1.84 MB

ใช้เวลา

0.022285 วินาที