Effects of plant extracts from family Zingiberaceae on CD34, Wilms Tumor 1, and Hippo signaling pathways in Leukemic stem cell line

ผลของสารสกัดจากพืชวงศ์ขิงต่อโปรตีนซีดี 34 วิล์มทูเมอร์ 1 และวิถีการส่งสัญญาณฮิปโปในเซลล์เพาะเลี้ยงต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาว

Name: Pawaret Panyajai

LCSH: Leukemia

LCSH: Biochemistry

LCSH: Toxicology

LCSH: Plant Extracts -- Analysis

Abstract: Leukemia is a hematopoietic disorder with frequent incidence and high mortality rate. Chemotherapy is an effective method for leukemia treatment. However, most chemotherapeutic drugs cause unpleasant side effects in cancer patients. Moreover, some patients fail to achieve complete remission and relapse because of uneliminated leukemic cells, known as leukemic stem cells (LSCs). These cells are more resistant to chemotherapeutic drugs than leukemic cells. CD34 is a protein marker in hematopoietic stem cells (HSCs) and LSCs. Although the function of this protein is still unknown, previous studies have indicated that CD34 is upregulated by activation of protein kinase C (PKC). Additionally, leukemia overexpressing Wilms’ tumor 1 (WT1) protein is involved in leukemogenesis. Previous studies have indicated that the Hippo signaling pathway is crucial for the regulation of organ growth and cell proliferation, with the YAP/TAZ proteins acting as protein mediators. Dysregulation of this pathway leads to cancer development. However, there is less research on this pathway in leukemia. Plants from the Zingiberaceae family have been utilized in traditional medicines and cuisines in Thailand. Many previous studies have demonstrated that plants from this family possess various biological activities. Many studies have indicated that unregulated inflammation is involved in the development and progression of cancer. Thus, suppressing unregulated inflammation is one strategy that could prevent cancer initiation. This study focuses on the cytotoxicity screening of plant extracts from the Zingiberaceae family in a KG-1a leukemic stem cell line, comparing their effects to other cells. Additionally, candidate plants and their active compounds were examined for cancer prevention properties. Finally, the effects of the candidate plant extracts and their active compounds on WT1, CD34, and the Hippo signaling pathways in LSCs were further investigated. The cytotoxic screening of 10 crude ethanolic extract plants by MTT assay across 5 cell lines, including KG-1a (leukemic stem cell), K562 (chronic myelocytic leukemia), MCF-7 (breast cancer cell), A549 (lung carcinoma cell), and HeLa (cervical carcinoma cell) was examined. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were used as a normal cell model to compare with cancer cells. The results indicated that crude ethanolic extracts from Curcuma longa, Curcuma zedoaria, and Zingiber officinale exhibited effective cytotoxicity against KG-1a cells. These extracts also showed significant cytotoxicity in K562, MCF-7, and HeLa cells, while demonstrating low cytotoxicity in PBMCs. The active compounds of C. longa and C. zedoaria are curcuminoids (curcumin, demethoxycurcumin, and bisdemethoxycurcumin), while shogaol and gingerol are active compounds of Z. officinale. The cancer prevention properties of candidate plant extracts and their active compounds were investigated using IL-2 and TNF-α ELISA kits, and nitric oxide (NO) assay. The results indicated that crude ethanolic extracts from these three plants and their active compounds showed cancer prevention properties, as they can decrease cytokine and NO levels. The inhibitory effect of crude ethanolic extracts from these three plants and their active compounds on CD34 and WT1 protein expressions in KG-1a cells was investigated by Western blotting. After KG-1a cells were treated with non-cytotoxic concentrations (IC20 values) of crude ethanolic extracts and their active compounds, the results showed that crude ethanolic extracts from these three plants and their active compounds could inhibit CD34 and WT1 protein expressions. Additionally, crude ethanolic extracts showed more effectiveness than their active compounds, especially in WT1 expression. Furthermore, Western blotting also revealed no expression of YAP protein in leukemic cell lines. While KG-1a cells exhibited a low level of TAZ protein expression. The effects of curcumin and shogaol on cell death and cell cycle in KG-1a cells were investigated by flow cytometry. The results revealed that curcumin and shogaol could arrest KG-1a cells at the G2/M phase with cytotoxic concentrations (IC50 values). Moreover, both active compounds induced cell death in a dose- and time-dependent manner. To explore the mechanisms of cell death induced by curcumin and shogaol in KG-1a cells, the cells were incubated with curcumin and shogaol at IC50 concentrations and the expression of apoptotic-related proteins were analyzed using Western blotting. The findings demonstrated that curcumin and shogaol induced cell death in KG-1a cells via apoptosis pathway by inhibiting the PI3K/Akt pathway, resulting in an upregulation of cleaved caspase-3 and PARP proteins. Additionally, curcumin and shogaol decreased the expression of WT1. However, no significant change was observed in TAZ after treatment, despite indications of reduction. In addition, the essential oils from 8 plants within the Zingiberaceae family were investigated for cytotoxicity in cancer and leukemic cell lines using MTT assay. The results indicated that the essential oil from Curcuma aeruginosa (CAEO) demonstrated the most effective cytotoxicity in K562 cells, whereas the essential oil from Zingiber ottensii (ZOEO) exhibited the highest cytotoxicity in MCF-7 cells. Subsequently, both essential oils were assessed for their impact on apoptosis, cell cycle arrest, and the cytotoxicity of essential oil-loaded nanoformulations in cell lines. Results from apoptosis and cell cycle analysis by flow cytometry revealed that CAEO arrested K562 cells at the G2/M phase and induced cell apoptosis in a dose-dependent manner. CAEO also exhibited anti-migration activity in MCF-7 cells. However, CAEO-loaded nanoemulsion formulations generally exhibited less cytotoxicity than CAEO alone, except for the nanoemulsion formulation against MCF-7 cells. On the other hand, ZOEO induced cell apoptosis in a dose-dependent manner but could not induce cell cycle arrest in MCF-7 cells. Moreover, formulated nanoemulsions and nanogels demonstrated significantly stronger cytotoxicity in A549, MCF-7, HeLa, and K562 cells than ZOEO alone. These findings indicate the potential of essential oils from plants within the Zingiberaceae family for leukemia and cancer treatment. In conclusion, these findings suggest that plant extracts from the Zingiberaceae family exhibit anti-cancer activities and cancer prevention properties. Furthermore, curcumin and shogaol, the main active compounds, demonstrated efficacy against leukemic stem cells. Thus, these two active compounds are suitable for study in the treatment of leukemia, which needs further investigation.

Abstract: มะเร็งเม็ดเลือดขาวเป็นความผิดปกติทางโลหิตวิทยาที่พบได้บ่อยและมีอัตราการตายสูง การใช้ยาเคมีบำบัดเป็นวิธีการรักษาโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวที่มีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตามยาเคมีบำบัดส่วนใหญ่ก่อให้เกิดผลข้างเคียงที่ไม่พึงประสงค์ต่อผู้ป่วย นอกจากนี้ยังมีผู้ป่วยบางรายที่ไม่ประสบผลสำเร็จในการรักษาและกลับมาเป็นโรคซ้ำ (relapse) เนื่องจากเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวที่ไม่ถูกกำจัดซึ่งเป็นเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาว (leukemic stem cells หรือ LSCs) เซลล์ดังกล่าวมีลักษณะที่ดื้อต่อยาเคมีบำบัดมากกว่าเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวทั่วไป โปรตีนซีดี 34 (CD34) เป็นโปรตีนบ่งชี้ต่อเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (hematopoietic stem cells หรือ HSCs) รวมไปถึงเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาว แม้จะยังไม่ทราบหน้าที่ของโปรตีนดังกล่าว แต่จากการศึกษาที่ผ่านมาพบว่าโปรตีนซีดี 34 มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นผ่านการกระตุ้นการทำงานโปรตีนไคเนส ซี (protein kinase C หรือ PKC) นอกจากนี้มะเร็งเม็ดเลือดขาวยังมีการแสดงออกของโปรตีนวิล์มทูเมอร์ 1 (Wilms’ tumor 1 หรือ WT1) ที่สูง ซึ่งเป็นโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการก่อมะเร็งเม็ดเลือดขาว ขณะเดียวกันหลายการศึกษาพบว่าวิถีการส่งสัญญาณฮิปโป (Hippo signaling pathway) มีความสำคัญต่อการควบคุมของพัฒนาการอวัยวะต่าง ๆ และการเจริญเติบโตของเซลล์ โดยมีโปรตีนแยป/ทาซ (YAP/TAZ) เป็นโปรตีนตัวกลาง ความผิดปกติของวิถีการส่งสัญญาณดังกล่าวส่งผลต่อการเกิดมะเร็งได้ อย่างไรก็ตามยังมีการศึกษาวิถีการส่งสัญญาณนี้ในมะเร็งเม็ดเลือดขาวที่น้อยอยู่ พืชวงศ์ขิงถูกนำมาใช้ในตำรับแพทย์แผนโบราณและอาหารไทย การศึกษาก่อนหน้านี้หลายรายงานบ่งชี้ว่าพืชวงศ์ขิงมีฤทธิ์ทางชีวภาพที่หลากหลายและมีการศึกษาที่ระบุถึงภาวะอักเสบที่ไม่มีการควบคุมเกี่ยวข้องกับการพัฒนาและลุกลามของมะเร็ง ดังนั้นการลดภาวะอักเสบที่ไม่มีการควบคุมจึงเป็นหนึ่งในวิธีป้องกันการเกิดมะเร็ง การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัดจากพืชวงศ์ขิงในเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวเพาะเลี้ยงชนิด KG-1a เทียบผลความเป็นพิษกับเซลล์อื่น ๆ รวมถึงศึกษาคุณสมบัติการป้องกันมะเร็ง และสุดท้ายได้ศึกษาผลของสารสกัดของพืชตัวแทน และสารออกฤทธิ์ของพืชดังกล่าวต่อโปรตีนซีดี 34 วิล์มทูเมอร์ 1 และวิถีการส่งสัญญาณฮิปโปในเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาว ผลการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ของสารสกัดหยาบเอทานอลจากพืชวงศ์ขิง 10 ชนิด โดยวิธี MTT ต่อเซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยง 5 ชนิด ได้แก่ เซลล์ KG-1a (เซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวเพาะเลี้ยง) K562 (มะเร็งเม็ดเลือดขาวชนิดเรื้อรังแบบมัยอีลอยด์) MCF-7 (มะเร็งเต้านม) A549 (มะเร็งปอด) และ HeLa (มะเร็งปากมดลูก) โดยเปรียบเทียบกับเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดนิวเคลียสเดี่ยว (peripheral blood mononuclear cells หรือ PBMCs) ซึ่งเป็นตัวแทนของเซลล์ปกติ พบว่าสารสกัดหยาบเอทานอลจากขมิ้นชัน ขมิ้นอ้อย และขิง ให้ผลความเป็นพิษต่อเซลล์ KG-1a ที่ดี สารสกัดดังกล่าวยังให้ผลความเป็นพิษได้ดีในเซลล์ K562, MCF-7 และ HeLa และยังมีผลความเป็นพิษที่ต่ำต่อเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิดนิวเคลียสเดี่ยวเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์มะเร็ง สารออกฤทธิ์ของขมิ้นชันและขมิ้นอ้อยคือสารกลุ่มเคอร์คิวมินอยด์ ประกอบด้วย เคอร์คิวมิน (curcumin) ดีเมททอกซีเคอร์คิวมิน (demethoxycurcumin) และบิสดีเมททอกซีเคอร์คิวมิน (bisdemethoxycurcumin) ส่วนสารออกฤทธิ์ในขิงคือ โชกาออล (shogaol) และจินเจอรอล (gingerol) จากนั้นศึกษาคุณสมบัติการป้องกันมะเร็งของสารสกัดจากขมิ้นชัน ขมิ้นอ้อยและขิง รวมทั้งสารออกฤทธิ์ของพืชทั้งสาม โดยชุดอีไลซ่า (ELISA) ตรวจวัดระดับ IL-2, TNF-α และชุดตรวจระดับไนตริกออกไซด์ (nitric oxide หรือ NO) ผลการศึกษาพบว่าสารสกัดหยาบเอทานอลและสารสำคัญจากพืชทั้งสามชนิดมีคุณสมบัติป้องกันมะเร็ง ซึ่งสามารถลดระดับไซโตไคน์ (cytokines) และไนตริกออกไซด์ (nitric oxide) ได้ผลการยับยั้งของสารสกัดหยาบเอทานอลและสารออกฤทธิ์จากพืชทั้งสามชนิดต่อการแสดงออกของโปรตีนซีดี 34 และวิล์มทูเมอร์ 1 ในเซลล์ KG-1a โดยวิธีเวสเทิร์น บลอท (Western blot) หลังจากทำการทดสอบด้วยสารสกัดหยาบเอทานอลและสารออกฤทธิ์ด้วยความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ (IC20) ผลการศึกษาพบว่าสารสกัดหยาบเอทานอลและสารออกฤทธิ์จากพืชทั้งสามชนิดสามารถที่จะยับยั้งการแสดงออกโปรตีนซีดี 34 และวิล์มทูเมอร์ 1 ได้ อย่างไรก็ตามจากการศึกษาการแสดงออกของโปรตีนแยป (YAP) ที่เกี่ยวข้องกับวิถีการส่งสัญญาณฮิปโปด้วยวิธีเวสเทิร์น บลอท พบว่าเซลล์มะเร็งเม็ดเลือดขาวเพาะเลี้ยงไม่มีการแสดงออกโปรตีนแยป ในขณะที่เซลล์ KG-1a มีการแสดงออกโปรตีนทาซในระดับต่ำ จากนั้นจึงทำการศึกษาผลของโชกาออลและเคอร์คิวมินต่อการตายของเซลล์และวัฏจักรของเซลล์ (cell cycle) โดยวิธีโฟลไซโตเมทรี ผลการศึกษาพบว่าความเข้มข้นที่เป็นพิษต่อเซลล์ (IC50) ของโชกาออลและเคอร์คิวมินสามารถยับยั้งวัฏจักรของเซลล์ได้ที่ระยะ G2/M ซึ่งสารออกฤทธิ์ทั้งสองยังกระตุ้นให้เซลล์ตายตามความเข้มข้นและระยะเวลาที่เพิ่มขึ้น เพื่อศึกษากลไกที่กระตุ้นการตายของเซลล์ในเซลล์ KG-1a จากโชกาออลและเคอร์คิวมิน ทำการทดสอบเซลล์ KG-1a ด้วยโชกาออลและเคอร์คิวมิน ที่ความเข้มข้นที่เป็นพิษต่อเซลล์ และศึกษาการแสดงออกของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับอะพอพโตซิสด้วยวิธีเวสเทิร์น บลอท ผลการศึกษาพบว่าโชกาออลและเคอร์คิวมินกระตุ้นการตายในเซลล์ KG-1a ผ่านกระบวนการตายแบบอะพอพโตซิส (apoptosis) โดยการยับยั้งวิถีการส่งสัญญาณ PI3K/Akt ส่งผลให้มีการเพิ่มขึ้นของโปรตีนคลีฟแคสเปส 3 (cleaved caspase-3) และคลีฟพาร์พ (cleaved PARP) นอกจากนี้โชกาออลและเคอร์คิวมินยังลดการแสดงออกโปรตีนวิล์มทูเมอร์ 1 ด้วย อย่างไรก็ตามไม่พบการเปลี่ยนแปลงของโปรตีนทาซที่ชัดเจนหลังได้รับสาร แม้จะมีแนวโน้มการแสดงออกที่ลดลง นอกจากนี้ยังได้ทำการศึกษาความเป็นพิษต่อเซลล์ของน้ำมันหอมระเหยจากพืชวงศ์ขิง 8 ชนิด โดยวิธี MTT ในเซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยง ผลการศึกษาพบว่าน้ำมันหอมระเหยขมิ้นดำให้ผลความเป็นพิษดีที่สุดต่อเซลล์ K562 ในขณะที่น้ำมันหอมระเหยไพลดำให้ผลความเป็นพิษที่ดีที่สุดต่อเซลล์ MCF-7 จากนั้น จึงทำการศึกษาผลของน้ำมันหอมระเหยทั้งสองต่อกระบวนตายแบบอะพอพโตซิส วัฏจักรของเซลล์ และผลความเป็นพิษต่อเซลล์มะเร็งเพาะเลี้ยงของตำรับนาโนที่บรรจุน้ำมัน จากผลการศึกษาพบว่าน้ำมันหอมระเหยขมิ้นดำสามารถยับยั้งวัฏจักรของเซลล์ได้ที่ระยะ G2/M และยังกระตุ้นการตายแบบอะพอพโตซิสในเซลล์ K562 ตามความเข้มข้นสารที่เพิ่มมากขึ้น น้ำมันหอมระเหยขมิ้นดำยังสามารถยับยั้งการเคลื่อนที่ของเซลล์ได้ จากการใช้เซลล์ MCF-7 เป็นต้นแบบในการศึกษา อย่างไรก็ตามตำรับนาโนอีมัลชันที่บรรจุน้ำมันหอมระเหยขมิ้นดำให้ผลความพิษต่อเซลล์ต่ำกว่าน้ำมันหอมระเหยขมิ้นดำที่ไม่ได้บรรจุในอนุภาคนาโน ยกเว้นตำรับนาโนอีมัลชันต่อเซลล์ MCF-7 ส่วนน้ำมันหอมระเหยไพลดำพบว่าสามารถกระตุ้นการตายแบบอะพอพโตซิสตามความเข้มข้นสารที่เพิ่มขึ้น แต่ไม่สามารถยับยั้งวัฏจักรของเซลล์ในเซลล์ MCF-7 ได้ นอกจากนี้ตำรับนาโนอีมัลชันและนาโนเจลที่บรรจุน้ำมันหอมระเหยไพลดำยังให้ผลความเป็นพิษต่อเซลล์ได้ดีกว่าน้ำมันหอมระเหยไพลดำที่ไม่ได้บรรจุในอนุภาคนาโนในเซลล์ A549, MCF-7, HeLa และ K562 การค้นพบนี้ชี้ให้เห็นถึงคุณสมบัติของน้ำมันหอมระเหยจากพืชวงศ์ขิงต่อการรักษามะเร็งเม็ดเลือดขาวและโรคมะเร็งได้เป็นอย่างดี จากการศึกษานี้สรุปผลการทดลองได้ว่าพืชวงศ์ขิงมีฤทธิ์ต้านมะเร็งและมีคุณสมบัติป้องกันมะเร็ง โดยเคอร์คิวมินและโชกาออลซึ่งเป็นสารออกฤทธิ์สำคัญมีคุณสมบัติทำลายเซลล์ต้นกำเนิดมะเร็งเม็ดเลือดขาวอีกด้วย สารออกฤทธิ์ทั้งสองชนิดนี้จึงมีคุณสมบัติเหมาะสมสำหรับใช้ศึกษาในการรักษามะเร็งเม็ดเลือดขาว ซึ่งจำเป็นจะต้องศึกษาเพิ่มเติมต่อไป

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Songyot Anuchapreeda

Role: Advisor

Name: Siriporn Okonogi

Role: Advisor

Name: Sawitree Chiampanichayakul

Role: Advisor

Created: 2024

Modified: 2024-12-23

Issued: 2024-11-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctor's degree

Descipline: Biomedical Science

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	611155904.pdf	2.21 MB	12	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.040135 วินาที