Selection of antagonistic bacteria for controlling fungal fruit rot disease of longan after harvest

การคัดเลือกเชื้อแบคทีเรียปฏิปักษ์เพื่อควบคุมโรคผลเน่าของลำไยหลังการเก็บเกี่ยว

Name: Aimalin Pipattanapuckdee

LCSH: Longan -- Harvesting

LCSH: Bacterial diseases of plants

LCSH: Antagonistic fungi

LCSH: Longan -- Postharvest diseases and injuries

LCSH: Postharvest diseases and injuries

LCSH: Plant diseases

LCSH: Fungal diseases of plants

Abstract: Postharvest longan fruit rot disease caused by fungi is the important problem that result in a great loss of longan production. Application of chemical to control the disease led to adverse effects on consumer health and environment, also, the chemical residue on fruits and exportation. This study aims to isolate, screen and select the potential antagonist bacterium for controlling and reducing the fruit rot disease of longan then develop into the bio-formulation prototype for using in further extending the shelf life and preserving quality of longan. A total of 34 fruit rot samples were obtained from longan orchard in Chiang Mai, Phrae and Lamphun Provinces. The results showed that the most pathogenic fungus is Lasiodiplodia sp. followed by Pestalotiopsis sp., Colletotrichum sp. and Phomopsis sp. Furthermore, Lasiodiplodia sp. (the most virulent pathogen) was identified according to its morphological and molecular characteristics by analysis of the internal transcribed spacer region (ITS) and translation elongation factor 1-alpha (EF1-α) genes. Therefore, this fungus was identified as Lasiodiplodia pseudotheobromae. To select the effective antagonistic bacteria for controlling L. pseudotheobromae, the endophytic bacteria were isolated from healthy parts of longan and the 1,413 isolates of endophytic bacteria were obtained and tested with dual culture technique. The results showed that the bacterium isolate RFCD306 was the most effective on inhibiting L. pseudotheobromae both mycelial growth and conidial germination. The bacterium isolate RFCD306 were identified according to the morphological, biological, biochemical and molecular characteristics by analysis of 16S rRNA gene and it was identified as Bacillus siamensis. The controlling efficacy of Bacillus siamensis RFCD306 against L. pseudotheobromae showed that mycelial growth was inhibited by creating a clear zone between the fungal pathogen and the antagonistic bacterium which could be calculated as 94.40% of inhibition. The efficacy of B. siamensis isolate RFCD306 on inhibition of conidial germination of L. pseudotheobromae was assayed and observed under light compound microscope and scanning electron microscope (SEM) revealed that conidia abortion at 54.48% and caused abnormal swelling germ tube of certain conidia and hypha. The antibiotic synthesis-related genes consisting of bacillomycin D (bacD), iturin A (ituA), surfactin (srfA) and bacilysin (bymA) genes were detected from B. siamensis RFCD306 using the polymerase chain reaction (PCR) technique. The detection of 4 antibiotic synthesis-related genes supported that one of the important mechanisms of B. siamensis RFCD306 on inhibition of L. pseudotheobromae was the production of antibiotic substances or antibiosis. The development of suitable bio-formulations for B. siamensis RFCD306, from out of 10 formulars, found that rice flour-2 was the most proper formulation with amount of bacterial concentration in final product was 1.75 × 1010 CFU/g. When testing the efficacy of mycelial growth inhibition with dual culture technique, it was found that the inhibitory effect was 80.00%. Though, the concentration of antagonistic bacteria was reduced to 5.80 × 107 CFU/g and the inhibition effect was reduced to 35.33% after stored the bio-formulation at room temperature for 6 months. The bio-formulation, rice flour-2 formulation, was applied on harvested longan then storage at 15°C with relative humidity 75%. The result found that the bio-products could delayed the progress of pericarp browning and decreased fruit rot disease by had significant browning index 1.83 and disease incidence 8.33%, respectively and extend shelf life of fresh longan for 13 days.

Abstract: โรคผลเน่าหลังการเก็บเกี่ยวของลำไยที่เกิดจากเชื้อสาเหตุโรคสร้างความเสียหายแก่ผลผลิตลำไยเป็นอย่างมาก การใช้สารเคมีในการควบคุมโรค พบว่า ก่อให้เกิดอันตรายต่อผู้บริโภค และการตกค้างของสารบนผลลำไย และส่งผลต่อการส่งออก งานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อคัดเลือกแบคทีเรียปฏิปักษ์ในการควบคุมและลดการเกิดโรคที่มีสาเหตุจากเชื้อรา และเพื่อพัฒนาชีวภัณฑ์ต้นแบบ รวมถึงวิธีการใช้ชีวภัณฑ์ร่วมกับสภาพการเก็บรักษาที่เหมาะสม สำหรับยืดอายุการเก็บรักษา และรักษาคุณภาพของลำไย การศึกษาจุลินทรีย์สาเหตุโรคผลเน่าหลังการเก็บเกี่ยวของลำไย 34 ตัวอย่าง จากพื้นที่ จังหวัดเชียงใหม่ ลำพูน และแพร่ พบว่า เชื้อรา Lasiodiplodia sp. เป็นสาเหตุของโรคผลเน่ามากที่สุด รองลงมาคือ Pestalotiopsis sp., Colletotrichum sp. และ Phomopsis sp. เมื่อนำเชื้อรา Lasiodiplodia sp. ที่พบมากที่สุดและมีความรุนแรงทำให้เกิดโรคได้รวดเร็วมาจัดจำแนกชนิดตามลักษณะสันฐานวิทยาและลักษณะทางชีวโมเลกุล โดยตรวจสอบบริเวณ internal transcribed spacer (ITS) และ translation elongation factor 1-alpha (EF1-α) พบว่า เป็นเชื้อรา Lasiodiplodia pseudotheobromae การคัดเลือกเชื้อจุลินทรีย์ปฏิปักษ์ที่มีประสิทธิภาพในการควบคุมเชื้อรา L. pseudotheobromae สาเหตุโรคผลเน่าหลังการเก็บเกี่ยวของลำไย โดยคัดเลือกเชื้อที่แยกได้จากส่วนต่าง ๆ ของลำไยที่ไม่เป็นโรค ซึ่งสามารถแยกได้ 1,413 ไอโซเลท เมื่อนำมาทดสอบด้วยวิธี dual culture ในการยับยั้งเส้นใยของเชื้อรา L. pseudotheobromae พบว่า แบคทีเรียไอโซเลท RFCD306 มีประสิทธิภาพในการยับยั้งเส้นใยเชื้อราได้มากที่สุด และเมื่อนำแบคทีเรียไอโซเลท RFCD306 มาจัดจำแนกชนิดตามลักษณะสันฐานวิทยา ชีวเคมี และชีวโมเลกุล โดยตรวจสอบยีนบริเวณ 16S rRNA พบว่า เป็นแบคทีเรีย Bacillus siamensis การตรวจสอบประสิทธิภาพของ B. siamensis ไอโซเลท RFCD306 ในการยับยั้งเชื้อรา L. pseudotheobromae พบว่า สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของเส้นใยได้ โดยเกิดบริเวณ clear zone ระหว่างเชื้อราสาเหตุและแบคทีเรียปฏิปักษ์ เมื่อนำมาคำนวนเปอร์เซ็นต์การยับยั้ง พบว่า สามารถยับยั้งได้ถึง 94.40% และยับยั้งการงอกของโคนิเดียของเชื้อราสาเหตุได้ 54.48% เมื่อนำไปตรวจสอบภายใต้กล้องจุลทรรศน์ light microscope และ SEM พบโคนิเดียบางส่วนที่งอกได้ germ tube มีลักษณะโป่งพองผิดปกติ เมื่อตรวจสอบยีนที่กำหนดการสร้างสารปฏิชีวนะจากแบคทีเรียปฏิปักษ์ B. siamensis RFCD306 ด้วยเทคนิค polymerase chain reaction (PCR) พบว่า ตรวจพบยีนที่กำหนดการสร้างสารปฏิชีวนะจำนวน 4 ยีน ประกอบไปด้วย bacillomycin D (bacD), iturin A (ituA), surfactin (srfA) และ bacilysin (bymA) จากการตรวจพบยีนที่กำหนดการสร้างสารปฏิชีวนะดังกล่าว ทำให้สามารถช่วยยืนยันได้ว่า หนึ่งในกลไกของแบคทีเรียปฏิปักษ์ในการยับยั้งเชื้อรา L. pseudotheobromae คือ การสร้างสารปฏิชีวนะ การพัฒนาสูตรชีวภัณฑ์ที่เหมาะสมสำหรับแบคทีเรีย B. siamensis ไอโซเลท RFCD306 จากการทดสอบทั้งหมด 10 สูตร พบว่า สูตรแป้งข้าวจ้าว-2 เป็นชีวภัณฑ์ต้นแบบที่มีความเหมาะสมมากที่สุด โดยมีปริมาณของเซลล์แบคทีเรียปฏิปักษ์ในชีวภัณฑ์หลังจากผลิตเสร็จที่ 1.75 × 1010 CFU/g เมื่อนำมาทดสอบประสิทธิภาพในการยับยั้งการเจริญของเส้นใยเชื้อราด้วยเทคนิค dual culture พบว่าสามารถยับยั้งได้ 80.00% แต่เมื่อเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิห้องนาน 6 เดือน พบปริมาณเซลล์แบคทีเรียปฏิปักษ์ในชีวภัณฑ์ลดลงเหลือ 5.80 × 107 CFU/g และความสามารถในการยับยั้งการเจริญเส้นใยของเชื้อราลดลงเหลือ 35.33% การทดสอบชีวภัณฑ์ต้นแบบ สูตรแป้งข้าวจ้าว-2 สำหรับ B. siamensis RFCD306 ร่วมกับสภาพการเก็บรักษาที่เหมาะสมที่อุณหภูมิ 15 องศาเซลเซียส ความชื้นสัมพัทธ์ 75% ช่วยรักษาคุณภาพของลำไยไว้ได้นานขึ้น พิจารณาจากการประเมิน มีแนวโน้มว่าสามารถเก็บรักษาลำไยสดได้นานที่สุด โดยมีอายุการเก็บรักษาประมาณ 13 วัน มีระดับการเกิดโรคผลเน่า 8.33% และมีระดับการเกิดสีน้ำตาลอยู่ที่ 1.83 ซึ่งเป็นค่าที่สามารถรับได้

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: On-Uma Ruangwong

Role: Advisor

Name: Kaewalin Kunasakdakul

Role: Advisor

Name: Pimjai Seehanam

Role: Advisor

Created: 2023

Modified: 2024-01-15

Issued: 2023-10-29

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Plant Pathology

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	600851003.pdf	7.35 MB	1	2025-01-21 12:05:00

ใช้เวลา

0.020124 วินาที