Isolation and characterization of novel defensin from Fabaceae seed and preliminary studies of mechanism of action

การแยกและศึกษาคุณลักษณะของดีเฟนซินชนิดใหม่จากเมล็ดพืชตระกูลถั่ว และกลไกลการออกฤทธิ์เบื้องต้น

Name: Santhasiri Orrapin

LCSH: Defensin

LCSH: Legumes

LCSH: Seeds

Abstract: An Emergence of drug resistant infection has led to increase in both morbidity and mortality rate. Besides, resistance to cancer drugs and the tumor heterogeneity are the serious obstacle for treatment and make it more disease complicated. Currently, several researches have focused on the discovery of effective agents to overcome these burdens. Defensins are classified as of antimicrobial peptide isolated from plant and are extremely high biodiversity. The previous studies reported that plant defensins exhibited broad spectrum antimicrobial activity against various pathogens and also represented anticancer activity in vitro. In this study, the isolation of defensin gene from five Fabaceae seeds was evaluated using 3’RACE-PCR and cDNA cloning. Nucleotide sequencing analysis revealed the identified cDNAs was ranged from 234 to 437 bp in length encoding for a protein of 75 amino acids with 28 residues N-terminal signaling sequence. Multiple sequences alignment indicated that novel defensins had overall identity over 92% as compared to previously reported plant defensins and were clustered to be subfamilies of Papilionoideae. In silico analysis demonstrated that the molecular weight of defensins were 5.4 to 5.6 kDa, net positive charge of +1 to +2 with the estimated pI of 7.72 to 8.22. The putative peptides were predicted to be antimicrobial peptide by j using bioinformatics as tools of data analysis. One of putative peptides, javanicin, was selected as a candidate defensin for functional studies in this study. Gene encoded for javanicin was fused with intein and expressed in E. coli Origami2 (DE3). This expression system facilitated one step purification of peptide through the affinity chromatography. After purification, a single band of approximately 6 kDa analyzed by SDS-PAGE analysis was apparent. The final recovery yield was 2.5 mg/L with purity greater than 90%. The recombinant javanicin was further assessed its biological activities of antimicrobial and anticancer activity. The results indicated that it exhibited antifungal activity against Candida albicans and the fluconazole-resistant strain, as well as Cryptococcus neoformans and filamentous fungi, Trichophyton rubrum. The preliminary mode of action of antifungal peptide was studied. The inhibitory effect of peptide by internalizing into the fungal cells without inducing morphological change was observed. Proteomic studies revealed that its action may involve in cellular process of carbohydrate metabolism/energy. Meanwhile, anticancer activity of javanicin was evaluated and it was implied that the peptide could diminish cell proliferation of both phenotypic difference of human breast cancer, MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Together with the result of FACs analysis, the inhibitory effect of peptide against MCF-7 cells was presumably associated with late apoptosis. The biocompatibility of javanicin against human red blood cells and mammary epithelial MCF-10A cells was determined, the results showed that peptide can induce toxic effect toward both human red blood cells and mammary epithelial MCF-10A cells at the concentration nearly comparable to the effective dose. Therefore, further investigation of javanicin needs to be performed for selectively improving or delivery modification before efficacy determination and application in vivo.

Abstract: อุบัติการณ์การเกิดโรคติดเชื้อดื้อยา ทำให้เกิดผลข้างเคียงและ โอกาสการเสียชีวิตจากการติด เชื้อที่เพิ่มมากขึ้น อีกทั้งการเกิดภาวะดื้อยาในโรคมะเร็ง และความหลากหลายของฟีโนไทป์ของ เซลล์มะเร็งเหล่านี้ เป็นอุปสรรคต่อการรักษาและทำให้มีความยุ่งยากซับซ้อนมากขึ้น หลายงานวิจัยใน ปัจจุบันจึงมุ่งเน้นให้ความสำคัญไปที่การค้นพบสารชนิดใหม่ที่สามารถนำมาใช้แก้ปัญหาการดื้อยา ดังกล่าว ดีเฟนซินเป็นเปปไทด์ด้านจุลชีพชนิดหนึ่งที่สามารถพบได้ในพืช จัดเป็นเปปไทด์ที่มีความ หลากหลายทางชีวภาพสูง จากรายงานวิจัยที่ผ่านมาพบว่าดีเฟนชินมีฤทธิ์กว้างขวาง สามารถทำลายได้ ทั้งเชื้อจุลชีพก่อโรคและบางชนิดสามารถฆ่าเซลล์มะเร็งได้ในหลอดทดลอง ในการศึกษาครั้งนี้ได้ ดำเนินการแยกยีนดีเฟนซินชนิดใหม่จากเมล็ดพืชตระกูลถั่วห้าชนิดด้วยวิธี 3’ RACE-PCR และการ โคลน cDNA ผลการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สมบูรณ์ของยีนดีเฟนชินที่แยกได้มีขนาดประมาณ 234 - 437 คู่เบส โดยสามารถแปลรหัสให้โปรตีนยาว 75 กรดอะมิโน ที่ประกอบไปด้วย signal peptide ทางด้าน N-terminus จำนวน 28 ตัว จากการเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของดีเฟนซินชนิด ใหม่กับดีเฟนซินจากพืชที่มีรายงานก่อนหน้านี้ พบว่ามีความคล้ายคลึงกันมากกว่า 92% และจัดอยู่ใน วงศ์ย่อย Papilionoideae ผลการศึกษาคุณลักษณะด้วยโปรแกรมคอมพิวเตอร์ พบว่าดีเฟนซินดัง กล่าวมีขนาดมวลโมเลกุล 5.4 -5.6 กิโลดาลตัน ประจุรวมเป็นบวก (+1 ถึง +2) มีค่าไอโซอิเล็กทริก เท่ากับ 7.72-8.22 จากการวิเคราะห์ด้วยโปรแกรมชีวสารสนเทศพบว่าเปปไทด์มีคุณสมบัติ เป็นเปปไทด์ด้นจุลชีพ เมื่อทำการศึกษาการแสดงออกของยีนจาวานิซิน หนึ่งในตัวแทนของดีเฟนซิน ชนิดใหม่ โดยให้มีการแสดงออกในรูปโปรตีนลูกผสมเชื่อมกับโปรตีu intein ในแบกที่เรีย E. coli สายพันธุ์ Origami2 (DE3) ซึ่งระบบการแสดงออกดังกล่าวสามารถทำให้สามารถทำให้เปปไทด์ บริสุทธิ์ได้ภายในขั้นตอนเดียวด้วยใช้เทคนิคแอฟฟินิตีโครมาโตกราฟี ภายหลังการทำให้เปปไทด์ บริสุทธิ์ พบแถบเปปไทด์ขนาดประมาณ กิโลดาลตัน เปปไทด์ที่ได้หลังจากการทำบริสุทธิ์มีปริมาณ 2.5 มิลลิกรัมลิตร และมีความบริสุทธิ์มากกว่า 90 เปอร์เซ็นต์ เมื่อทำการประเมินฤทธิ์ทางชีวภาพใน การยับยั้งการเจริญของเชื้อจุลชีพและเซลล์มะเร็ง ซึ่งพบว่าเปปไทด์มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของ เชื้อรา Candida albicans และสายพันธุ์ ที่ดื้อต่อยา Fluconazole รวมไปถึง Cryptococcus neoformans และราสาย Trichopiton rubrum จากการศึกษากลไกการออกฤทธิ์ด้านเชื้อราในเบื้องต้นของเปปไทด์ จาวานิชินต่อเชื้อ C. neoformans พบว่าเปปไทด์ออกฤทธิ์ โดยการผ่านเข้าไปในเซลล์ของเชื้อ โดยไม่ เหนี่ยวนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงลักษณะภายนอกของเซลล์ เมื่อศึกษาโดยอาศัยการวิเคราะห์ ด้วยเทคนิคโปรติโอมิกส์ พบว่าการออกฤทธิ์ของเปปไทด์อาจมีบทบาทเกี่ยวข้องกับกระบวนการ เมตาบอลิซึมของคาร์โบไฮเดรตและการสร้างพลังงาน ในขณะเดียวกันผลการศึกษาฤทธิ์ในการต้าน เซลล์มะเร็ง พบว่าเปปไทด์สามารถยับยั้งการเจริญเติบโตของมะเร็งเต้านมสองชนิด ที่มีความแตกต่าง กันทางด้านฟีโนไทป์คือเซลล์ MCF-7 และ MDA- MB-231 ผลการศึกษาด้วยเทคนิค low cytometry ในเซลล์มะเร็ง MCF-7 พบว่าฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของเซลล์มะเร็งของเปปไทด์อาจเกี่ยวข้องกับ การตายแบบอะพอพโทซิสระยะท้าย อย่างไรก็ตามจากการทดสอบความเข้ากันได้ทางชีวภาพของจา วานิซินกับเซลล์เซลล์เม็ดเลือดแดงและเซลล์เยื่อบุผิวจากเต้านม MCF-10A พบว่าเปปไทด์มีความเป็น พิษต่อเซลล์ทั้งสองชนิดที่ความเข้มขัน ใกล้เคียงกับคำที่ออกฤทธิ์ทำลายเชื้อจุลชีพหรือยับยั้งการเจริญ ของเซลล์มะเร็ง ดังนั้นเปปไทด์จาวานิซินจึงควรมีการศึกษาวิจัยเพื่อปรับปรุงหรือดัดแปลงการนำส่งที่ ดี เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของเปปไทด์ในการเลือกจับก่อนการนำไปศึกษาประสิทธิผลและการประยุกต์ใช้ในสิ่งมีชีวิตต่อไป

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Sorasak Intorasoot

Role: Advisor

Name: Khajornsak Tragoolpua

Role: Advisor

Name: Amornrat Intorasoot

Role: Advisor

Created: 2020

Modified: 2024-01-06

Issued: 2023-10-21

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biomedical Science

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	591155901.pdf	5.09 MB

ใช้เวลา

0.025501 วินาที