การถ่ายยีน Bt เข้าสู่เนื้อเยื่อสัก (Tectona grandis Linn)

Transformation of Bt gene into teak (Tectona grandis Linn)

Name: ประกาย อ่อนวิมล

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ -- วิทยานิพนธ์. ปร.ด. (เทคโนโลยีชีวภาพเกษตร) 2560.

Classification :.LCCS: SD397.T4

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. -- สาขาเทคโนโลยีชีวภาพเกษตร -- วิทยานิพนธ์

ThaSH: ไม้สัก

ThaSH: การแปลงยีน

ThaSH: ยีน

Abstract: การถ่ายยีน Cry1 Ab เข้าสู่ข้อและยอดกลุ่มของต้นสักโดยใช้ Agrobacterium tumefaciens สายพันธุ์ EHA105 ที่มีพลาสมิด pCAMBIA1302Ab ที่ประกอบด้วยยีน Cry1 Ab และมียีน hpt เป็นยีนคัดเลือกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ CaMV 35S ในการถ่ายยีนใช้เซลล์แขวนลอยเชื้อA. tumefaciens ที่มีค่า OD600 ประมาณ 1.2 สร้างบาดแผลบนผิวเนื้อเยื่อโดยใช้เครื่อง sonicator เป็น เวลา 3 นาที่การปลูกเชื้อทำโดยวิธี vacuum infiltration โดยใช้ความดัน 600 mmHg นาน 5 นาที จากนั้นเลี้ยงร่วมกับเชื้อเป็นเวลา 3 วัน หลังจากการถ่ายยีนเข้าสู่ข้อสักจำนวน 300 ข้อและยอดกลุ่ม 300 ชิ้น พบว่า ได้ข้อและยอดที่สามารถเจริญเติบโตบนอาหารคัดเลือกที่เติมสารปฏิชีวนะไฮโกร ไมซิน 50 มิลลิกรัมต่อลิตร จำนวนอย่างละ 2 ชิ้น หลังจากนั้นนำเนื้อเยื่อที่รอดชีวิตมาชักนำให้เกิด แคลลัสและยอดบนอาหารสูตร MS ที่เติม BA 2 มิลลิกรัมต่อลิตร สำหรับแคลลัสเมื่อนำไป ตรวจสอบการคงอยู่ของยี่น Cry1 Ab ด้วยเทคนิค PCR พบแถบดีเอ็นเอของยีน Cry1 Ab และเมื่อ ตรวจสอบการแสดงออกของยีนในระดับ mRNA ด้วยเทคนิค PCR โดยใช้ first strand cDNA เป็น ดีเอ็นเอ้ตนแบบ พบแถบดีเอ็นเอของยีน Cry1 Ab เช่นเดียวกัน สำหรับยอดกลุ่มนั้นหลังจากตัดแยกไปเพาะเลี้ยงบนอาหารสูตร MS ที่ไม่เติมสารควบคุมการเจริญเติบโตเพื่อเพิ่มปริมาณ ได้ต้นใหม่ จำนวน 3 ต้น ซึ่งเมื่อตรวจสอบการคงอยู่ของยี่น Cry1 Ab และยีน hpt ในทุกใบของแต่ละต้นด้วยเทคนิค PCR พบการคงอยู่ของยีน Cry1 Ab เพียงยีนเดียวจำนวน 8 ใบ และยีน hpt เพียงยีนเดียวจำนวน 15 ใบ และมีใบที่พบทั้งสองยีนจำนวน 8 ใบ และที่ไม่พบการคงอยู่ของทั่งสองยีนจำนวน 6 ใบ แสดงวายอดที่ได้มียีนอยู่จริงแต่เนื้อเยื่อมีลักษณะเป็น chimera เมื่อนำตัวอย่างใบสักที่พบว่ามีการคงอยู่ของยีน Cry1 Ab และยีน hpt ทั้งสองยีนจำนวน 5 ใบ ไปตรวจสอบการแสดงออกของยีน Cry1 Ab โดยตรวจสอบการสร้างโปรตีน Cry1 Ab ในเนื้อเยื่อด้วยเทคนิค ELISA พบว่าตัวอย่างทั้งหมดมีการสร้างโปรตีน Cry1 Ab Genetic transformation of Cry1 Ab into node and multiple shoots of teak using Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 harboring pCAMBIA1302 were investigated. Plasmid pCAMBIA1302Ab consisted of CryI Ab and the selectable marker gene, hpt. Both genes are under the control of CaMV35S promoter. In transformation method, the suspension cells of A. tumefaciens at OD600 1.2 was used. The wound on the tissue was done by 3 minutes sonication. The vacuum infiltration at 600 mmHg for 5 min was applied for infection. Co-cultivation period was performed for 3 days. The results showed that out of 300 nodes and 300 multiple shoots, 2 nodes and 2 multiple shoots could grow in 50 mg•L-1 hygromycin selective medium. These tissues were transferred to MS medium supplemented with 2 mg•L-1 BA for callus and shoot induction. The presence of Cry1 Ab gene in putative transformed calli using PCR was detected. The examination of Cry1 Ab expression by PCR of first strand cDNA template was also confirmed the presence of Cry1 Ab mRNA. These results confirmed the presence of the transgene in the tested calli. In the transformed multiple shoots, they were transferred to hormone-free MS medium and three new shoots were produced. All transgenic plants were repeatedly investigated a presence of Cry1 Ab and hpt gene in all leaves by PCR technique. Eight leaves of transgenic plants contained only Cry1 Ab gene while 15 leaves were found to contain only the hpt gene. There were 8 leaves that were found to contain both genes. The 6 leaves were not found any of these two genes. These findings indicated that these three transgenic shoots were chimera. Five leaves that contained both genes were investigated for the production of Cry1 Ab protein using ELISA technique. The result revealed that all of sample showed the positive result.

มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สำนักหอสมุด

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: tdckulib@ku.ac.th

Name: เสริมศิริ จันทร์เปรม

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

Name: สนธิชัย จันทร์เปรม

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม

Created: 2560

Modified: 2566-06-15

Issued: 2566-06-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: https://kasetsart.idm.oclc.org/login?url=https://www.lib.ku.ac.th/KUthesis/2560/prakay-onw-all.pdf

CallNumber: SD397.T4.ป173

tha

DegreeName: ปรัชญาดุษฎีบัณฑิต

Level: ปริญญาเอก

Descipline: เทคโนโลยีชีวภาพเกษตร

Grantor: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

©copyrights มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	prakay-onw-all.pdf	72.03 MB

ใช้เวลา

0.030585 วินาที