การผลิตและการทดสอบคุณสมบัติของเปปไทด์ Androgenic Gland Hormone ชองกุ้งก้ามกราม (Macrobrachium rosenbergii)

Production and functional analysis of a recombinant peptide Macrobrachium rosenbergii androgenic gland hormone

Name: สุทิน เอี่ยมไพศาล

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ -- วิทยานิพนธ์. วท.ม. (เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ) 2560

Classification :.LCCS: SH380.64.M33

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สาขาเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ -- วิทยานิพนธ์

ThaSH: กุ้งก้ามกราม -- พันธุศาสตร์

ThaSH: เปปไทด์ฮอร์โมน

ThaSH: เปปไทด์

Abstract: การเลี้ยงกุ้งก้ามกราม (Macrobrachium rosenbergii) เพศผู้ล้วนสามารถสร้างผลผลิตและ ให้ผลตอบแทนแก่เกษตรกรได้มากกว่า การเลี้ยงกุ้งก้ามกรามเพศเมียล้วน และการเลี้ยงรวมทั้ง 2 เพศ อีกทั้งยังได้มีการค้นพบว่า ต่อม androgenic gland (AGs) เป็นต่อมที่พบเฉพาะในเพศผู้ของ สิ่งมีชีวิตครัสเตเชียนเท่านั้น โดยต่อม AG เป็นแหล่งผลิตฮอร์โมน androgenic gland (AGH) ที่ ควบคุมการสร้างลักษณะเพศผู้ของกุ้งก้ามกราม และมียีน Insulin-like androgenic gland factor (IAG) กำหนดการผลิตฮอร์โมนดังกล่าวการศึกษาในครั้งนี้ได้นำ cDNA ของยีน Mr-IAG โคลนเข้า สู่เวคเตอร์ pPIC9K เพื่อที่จะใช้ระบบการผลิตโปรตีนของยีสต์ (Pichia pastoris) สำหรับผลิต ฮอร์โมน AGH ของกุ้งก้ามกราม ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า เมื่อเหนี่ยวนำการผลิตฮอร์โมนที่ ระดับเมทานอล 1% ของปริมาตรอาหารเลี้ยง เชื้อเป็นระยะเวลา 2 วัน ยีสต์สามารถผลิตฮอร์โมน AGH และหลั่งออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อได้มากที่สุด และทดลองตกตะกอนโปรตีนด้วย TCA แล้ว ละลายตะกอนด้วยบัฟเฟอร์ที่มียูเรียความเข้มข้น 6 M เป็นองค์ประกอบ พบว่า สามารถให้โปรตีนที่ มีคุณภาพดีกว่า การตกตะกอนด้วย ASF นอกจากนี้ยังได้ตรวจสอบกระบวนการหลังการแปลรหัส ในฮอร์โมน AGH ที่ผลิตในยีสต์พบว่า มีการสร้างพันธะไดซลไฟด์และการเติมหมู่คาร์โบไฮเดรต เช่นเดียวกับฮอร์โมน AGH ที่ผลิตในก้งุก้ามกราม อย่างไรก็ตามฮอร์โมน AGH ที่ผลิตได้ในครั้งนี้ ไม่สามารถที่จะถูกทำให้บริสุทธิ์ได้ไม่ว่า จะใช้วิธี FPLC หรือวิธี manual purification ก็ตาม ดังนั้น สำหรับการทดสอบคุณสมบัติของฮอร์โมน AGH ต่อการเหนี่ยวนำ ให้เกิดลักษณะเพศผู้ในกุ้งก้ามกรามนั้นได้ใช้สารละลายโปรตีนที่ประกอบด้วยโปรตีนทั้งหมดที่ยีสต์หลั่งออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ ซึ่งรวมทั้งฮอร์โมน AGH ด้วยแต่เมื่อตรวจสอบกุ้งก้ามกรามเพศเมียที่ได้รับสารละลายโปรตีนดังกล่าว พบว่า ไม่สามารถแสดงลักษณะภายนอกของกุ้งก้ามกรามเพศผู้ได้ในขณะที่กุ้งก้ามกรามเพศเมียที่ได้รับการปลูกถ่ายต่อม AG สามารถสร้าง appendix masculina ซึ่งเป็นลักษณะของกุ้งเพศผู้ได้สำเร็จ ดังนั้นอาจเป็นไปได้ที่ ฮอร์โมน AGH ที่ผลิตได้ในครั้งนี้ไม่ได้อยู่ในสภาวะที่สามารถทำหน้าที่ได้จึงจำเป็นอย่างยิ่ง ที่จะต้องมีการปรับโครงสร้างของโปรตีนให้เหมาะสมเพื่อที่จะผลิตฮอร์โมน AGH ที่สามารถแสดงคุณสมบัติได้เช่นเดียวกับฮอร์โมนที่ผลิตในก้งุก้ามกราม Yields of all-male Macrobrachium rosenbergii cultures are substantially greater and more profitable to farmers than those of either all-female or mixed. Androgenic Gland (AGs) are male specific tissues and able to induce male differentiation in several crustaceans, including M. rosenbergii. They produce androgenic gland hormone (AGH) encoded by an insulin-like androgenic gland factor (IAG) gene. In this study, Mr-IAG cDNA encoding B-C-A chains of the Mr-AGH was cloned into a pPIC9K vector in order to express the recombinant Mr-AGH in yeast system. Induction of the expression with 1% methanol for 2 days showed highest level of the secreted recombinant Mr-AGH in Pichia pastoris. Precipitation of the secreted protein using trichloroacetic acid (TCA) followed by solubilisation in a buffer containing 6 M Urea provided an integrity of the recombinant Mr-AGH over using saturated ammonium sulfate (ASF). Post translational modifications including glycosylation and disulfide formation were observed in the recombinant Mr-AGH. Unfortunately, the His-tagged recombinant Mr-AGH was unable to purify using either FPLC or manual purification methods. Thus, the total protein collected from the culture media containing the recombinant Mr-AGH was used in in vivobioassay. While AG implantation successfully induced an appearance of the male appendix masculina in immature females, such masculinizing property was not observed when injected with the recombinant Mr AGH. It is possibly due to the Mr-AGH produced in P. pastoris was not in an active form and re engineering the construct is needed.

มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สำนักหอสมุด

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: tdckulib@ku.ac.th

Name: ณิชนันทน์ แมคมิลแลน

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

Name: ประพันธ์ศักดิ์ ศีรษะภูมิ

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม

Name: สาธิตา ตปนียากร

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม

Created: 2560

Modified: 2566-05-22

Issued: 2566-05-22

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: https://kasetsart.idm.oclc.org/login?url=https://www.lib.ku.ac.th/KUthesis/2560/suthin-iam-all.pdf

CallNumber: SH380.64.M33.ส44

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ

Grantor: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

©copyrights มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	suthin-iam-all.pdf	4.22 MB

ใช้เวลา

0.022205 วินาที