การพัฒนาอิมมูโนโครมาโทกราฟิคสตริปเพื่อตรวจสอบอะฟลาทอกซินรวมในตัวอย่างข้าวโพดโดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 4G6

Development of one-step immunochromatographic strip for the detection of total aflatoxin in corn sample using monoclonal antibody clone 4G6

Name: วรลักษณ์ ฆะปัญญา

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ -- วิทยานิพนธ์. วท.ม. (โรคพืช) 2559.

Classification :.LCCS: SB608.M2

ThaSH: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. -- สาขาโรคพืช -- วิทยานิพนธ์

ThaSH: ข้าวโพด -- โรคและศัตรูพืช

ThaSH: อะฟลาท็อกซิน

ThaSH: สารพิษจากเชื้อรา

Abstract: งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในการพัฒนาชุดตรวจสอบสารพิษอะฟลาทอกซินแบบรวดเร็ว โดยใช้เทคนิคอิมมูโนโครมาโทกราฟี โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีจากเซลล์ไฮบริโดมาโคลน 4G6 ที่มี isotype ชนิด IgG2b และสร้าง light chain โดยมี %cross reaction กับ AFB1, AFB2, AFG1 และ AFG2 เท่ากับ 100, 89.2, 82.6, and 72.7 % ตามลำดับ เลี้ยงเซลล์ไฮบริโดมาใน Integra CELLine เพื่อผลิตแอนติบอดีในสภาพ in vitro แล้วนำมาแยกแอนติบอดีให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี Affinity column chromatography โดยใช้คอลัมน์ HiTrapTM Protein G HP ร่วมกับ เครื่องแยกสาร AKTAprime plus ได้แอนติบอดีรวมทั้งสิ้น 24 mg เตรียม conjugate probe โดยนำแอนติบอดีมาเชื่อมกับอนุภาคทอง เปรียบเทียบอนุภาคขนาด 20 และ 40 nm การทดสอบสภาวะที่เหมาะสมของอิมมูโนโครมาโต กราฟิคสตตริปโดยมีเป้าหมายของค่า Cut off ที่ 20 ng/mL ซึ่งเป็นค่าที่กำหนดไว้ของประเทศไทย พบว่า ควรฉีดพ่น Goat anti-mouse IgG และ Aflatoxin B1– bovine serum albumin ความเข้มข้น 0.25 mg/mL บริเวณ Control line และ Test line ตามลำดับ และฉีดพ่น โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่เชื่อมกับ อนุภาคทองขนาด 40 nm บริเวณ Conjugate release pad เตรียมตัวอย่างโดยใช้ 70% Methanol ในการสกัดสารพิษออกจากตัวอย่างตามวิธีการมาตรฐาน เจือจางสารสกัดที่ได้ด้วย Tris buffer saline - 0.05% Tween 20 (TBST) อัตราส่วน 1:4 ก่อนหยดลงบนส่วน sample application pad ตรวจสอบผลของปฏิกิริยาภายใน 15 นาที การทดสอบตัวอย่างข้าวโพดที่มีการปนเปื้อนสารอะฟลาทอกซินตามธรรมชาติ จำนวน 35 ตัวอย่าง พบตัวอย่างที่มีการปนเปื้อนสารอะฟลาทอกซินในระดับมากกว่าหรือ เท่ากับ 20 µg/kg จำนวน 14 ตัวอย่าง และการปนเปื้อนในปริมาณที่ต่ำกว่า 20 µg/kg จำนวน 21 ตัวอย่าง ซึ่งผลการวิเคราะห์ปริมาณสารอะฟลาทอกซินโดยวิธี ELISA จากตัวอย่างที่ 7, 14, 21, 28 และ 35 พบว่า มีปริมาณสารพิษ <4 9.6 19.9 10.5 และ 39.7 µg/kg ตามลำดับ ซึ่งสอดคล้องกับผลของการวิเคราะห์โดยอิมมูโนโครมาโตกราฟิคสตริป The objective of this research was to develop a rapid detection kit for total aflatoxin by immunochromatography using the monoclonal antibody (MAb) from hybridoma cell line 4G6 which produced IgG2b isotype and lambda light chain. The MAb recognizes all four aflatoxins, e.g. AFB1, AFB2, AFG1and AFG2 with the cross reactivity at100%, 89.2%, 82.6%, and 72.7%, respectively. In vitro propagation of the hybridoma was carried out using an Integra CELLine and the antibody was purified by Affinity column chromatography using HiTrapTM Protein G HP columnand AKTAprime plus purification system. Twenty four milligrams of the total antibody was obtained. The conjugate probe was prepared by comparing two sizes of colloidal gold particles at 20 and 40 nm in diameter for the conjugation with the MAb. The target cut off value of the developed immunochromatographic strip (ICS) was at 20 ng/mL according to the regulation limit in Thailand. Optimization for the strip reaction conditions were as followings; Goat anti-mouse IgG and Aflatoxin B1-bovine serum albumin at the concentrations of 0.25 mg/mL should be immobilized at the Control and Test lines, respectively; the MAb conjugate with 40 nm colloidal gold particle should be immobilized at the conjugate release pad. The sample was extracted with 70% Methanol and diluted 1:4 with Tris buffer saline -0.05%Tween 20 before applied on the sample application pad and the reaction could be visualized within 15 min. Analysis of 35 naturallycontaminated corn samples indicated that there were 14 samples contained ≥ 20 µg/kg and 20 samples contained < 20 µg/kg. The results from samples no. 7, 14, 21, 28 and 35 were analyzed by ELISA and showed the contamination at <4, 9.6, 19.9, 10.5 and 39.7 µg/kg, respectively which delivered a good correlation to the results from ICS analysis.

มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์. สำนักหอสมุด

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: tdckulib@ku.ac.th

Name: รัชนี ฮงประยูร

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์หลัก

Name: อมรา ชินภูติ

Role: อาจารย์ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์ร่วม

Created: 2559

Modified: 2566-05-11

Issued: 2566-05-11

วิทยานิพนธ์/Thesis

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: https://kasetsart.idm.oclc.org/login?url=http://lib.ku.ac.th/kuthesis/2559/woraluk-kha-all.pdf

CallNumber: SB608.M2 .ว172

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: โรคพืช

Grantor: มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

©copyrights มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	woraluk-kha-all.pdf	2.8 MB

ใช้เวลา

0.03471 วินาที