Mechanisms of dihydrochalcone-induced human cancer cell death

กลไกการตายของเซลล์มะเร็งมนุษย์ที่ถูกเหนี่ยวนำโดยไดไฮโดรชาล์โคน

Name: Wasitta Rachakhom

LCSH: Cell death

LCSH: Cancer

LCSH: Cancer cells -- Differentiation

LCSH: Cancer cells -- Growth

Abstract: Dihydrochalcone derivatives (DHCs), a sub-class of chalcone, possess several biological activities such as anti-microorganism, antioxidant, anti-inflammation, and anti-cancer activities. There are many DHCs that have been reported for their induction of cancer cell death via various pathways. DHCs in this study consist of 4′,6′-dihydroxy-2′,4-dimethoxy-5’-(2″-hydroxybenzyl)dihydrochalcone (DHC-1), a natural DHC, was extracted from leaves and twigs of Cyathostemma argenteum and 2′,6′-dihydroxy-4,4′-dimethoxydihydrochalcone (synthetic DHC, called calomelanone or DHC-2). The aims of this study were to determine the cytotoxic effects of DHCs on various cancer cell types including human breast cancer cells (MDA-MB-231 and MCF-7 cells) and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and to investigate the modes of cell death and mechanisms involved. The cytotoxic effect of DHCs was determined by MTT assay and it was found that both DHCs, DHC-1 and DHC-2, reduced cell viability of MDA-MB-231 (aggressive) and MCF-7 (non-aggressive) cells, whereas they were less toxic to normal cells, viz., peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and murine fibroblasts NIH3T3 cells. In addition, both DHCs also induced both breast cancer cells early apoptosis, which was examined by using annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)/propidium iodide (PI) staining and employed flow cytometry technique. Due to DHC-1 was cytotoxic towards breast cancer cells more than DHC-2, thus DHC-1 was selected for further studies. PI staining was utilized to characterize mode of cell death and cell morphology. Condensed nuclei and apoptotic bodies were found after DHC-1 treatment in both breast cancer cells. DHC-1 enhanced the cell cycle checkpoint genes, atm and atr, leading to the upregulation of BH3-only pro-apoptotic proteins including Bim, Bad, Bid and tBid. These proteins triggered mitochondrial transmembrane potential (ΔΨm) loss and activated caspase-9, an initiator caspase in intrinsic apoptosis pathway. DHC-1 also induced caspase-8 activity, which is also an initiator caspase of extrinsic apoptosis pathway. Moreover, DHC-1 induced ER stress by up-regulating the calcium levels in both cytosol and mitochondria. In addition, DHC-1 promoted apoptosis by EGFR/MAPK suppression. DHC-1 combined with imatinib, sorafenib and smac mimetic (BV6) showed the synergistic effects in MDA-MB-231 cells and additive effects in MCF-7 cells. In conclusion, DHC-1 induced breast cancer MDA-MB-231 and MCF-7 cells apoptosis via intrinsic, extrinsic, and ER stress pathways. Furthermore, inhibition of EGFR/MAPK signaling pathway was found in MCF-7 cells. Therefore, DHC-1 might be applied for alternative treatment for breast cancer patients. The cytotoxic effect of DHC-2 was investigated in hepatocellular carcinoma HepG2 cells. The HepG2 cell viability was inhibited after DHC-2 treatment at 48 and 72 h but not at 24 h. The levels of hydrogen peroxide (H2O2) or peroxide radicals (O2•−2) and superoxide anion radicals (O2•−) were increased in DHC-2-treated HepG2 cells resulting in cell stress and damage. DHC-2 stimulated apoptosis under oxidative stress condition by inducing the expression of Bax and Bak (pro-apoptotic proteins) whereas Bcl-xL (anti-apoptotic protein) was suppressed. The reduction of ΔΨm and increased caspase-9, -8 and -3 activities were found in DHC-2-treated HepG2 cells. Autophagic vacuoles, a character of autophagic cells, was found after DHC-2 treatment at 24 h. DHC-2 promoted autophagy mechanism by reduced expression of Akt, an autophagy regulator protein, and increasing the expression of Atg5, autophagic protein markers. DHC-2 induced autophagy to protect HepG2 cells from cell death. Nevertheless, co-treatment of DHC-2 with an autophagy inhibitor, 3-methyladenine (3-MA), could inhibit HepG2 cell viability. In conclusion, DHC-2-induced intrinsic and extrinsic pathways via ROS generation or oxidative stress. DHC-2 also induced autophagy mechanism for HepG2 cell survival. Combination of DHC-2 with 3-MA might be applied as anti-cancer agents for HCC patients. In summary, both DHC derivatives possessed the anticancer effects either on human breast or liver cancer via intrinsic and extrinsic pathway of apoptotic cell death. However, in hepatocellular carcinoma HepG2 cells in the short incubation time, the cells underwent autophagy which promoted cell survival.

Abstract: สารอนุพันธ์ไดไฮโดรชาลโคนจัดเอยู่ในกลุ่มย่อยของชาล์โคน มีฤทธิ์ทางชีวภาพหลายอย่าง เช่น ต้านจุลินทรีย์ ต้านอนุมูลอิสระ ต้านการอักเสบ และต้านมะเร็ง มีการศึกษาพบว่า อนุพันธ์ไดไฮโดรชาล์โคนสามารถกระตุ้นให้เซลล์มะเร็งตายโดยวิถีต่างๆ อนุพันธ์ไดไฮโดรชาล์โคนในการศึก-ษานี้ประกอบด้วย 4′,6′-ไดไฮดรอกซี-2′,4-ไดเมทอกซี-5′-(2′′-ไฮดรอกซีเบนซิล)ไดไฮโดรชาล์โคน (DHC-1) ซึ่งสกัดจากใบและกิ่งต้นนมแมวแดง (Cyathostemma argenteum) และ 2′,6′-ไดไฮ- ดรอกซี-4,4′-ไดเมทอกซีไดไฮโดรชาล์โคน (เป็นไดไฮโดรชาลโคนสังเคราะห์เรียกว่า คาโลมีลาโนน หรือ DHC-2) วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อศึกษาความเป็นพิษของไดไฮโดรชาล์โคนต่อเซลล์มะเร็งมะเร็งเต้านมมนุษย์ ได้แก่ เซลล์ MDA-MB-231 และ MCF-7 และเซลล์มะเร็งตับมนุษย์ ได้แก่ เซลล์ HepG2 และศึกษากลไกการตายและชนิดการตาย ความเป็นพิษของไดไฮโดรชาล์โคนโดยวิธี MTT พบว่าไดไฮโดรชาล์โคนทั้งสองชนิด คือ DHC-1 และ DHC-2 ยับยั้งการเจริญเติบโตของเซลล์ MDA-MB-231 (ชนิดรุนแรง) และเซลล์ MCF-7 (ชนิดไม่รุนแรง) และเป็นพิษน้อยต่อเซลล์ปกติได้แก่เซลล์ PBMCs และเซลล์ NIH3T3 นอกจากนี้ไดไฮโดรชาล์โคนทั้งสองยังกระตุ้นเซลล์มะเร็งเต้านมให้ตายแบบอะพอพโทซิสระยะต้นโดยการย้อมสี Annexin V/PI และวิเคราะห์โดยโฟลไซโตเมทรี เนื่องจาก DHC-1 มีความเป็นพิษสูงกว่า DHC-2 ดังนั้นการทดลองต่อไปจะศึกษากลไกการตายที่เหนี่ยวนาโดย DHC-1 การย้อมเซลล์ด้วย PI ใช้เพื่อแยกชนิดและรูปร่างสัณฐานวิทยาของเซลล์ พบการแน่นของนิวเคลียสและอะพอพโท-ติกบอดี้ในเซลล์ MDA-MB-231 และเซลล์ MCF-7 นอกจากนี้ DHC-1 ยังเพิ่มการแสดงออกของยีนควบคุมวัฏจักรเซลล์ ได้แก่ ยีน atm และ atr ทาให้โปร-อะพอพโทติคโปรตีนเพิ่มขึ้น ได้แก่ Bim, Bad และ tBid ส่งเสริมให้ศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียลดลงและกระตุ้นเอนไซม์คาสเพส 9 ซึ่งเป็นคาสเพสเริ่มต้นของวิถีภายในของการตายอะพอพโทซิส นอกจากนี้ DHC-1 ยังกระตุ้นเอนไซม์คาสเพส 8 ซึ่งเป็นคาสเพสเริ่มต้นของวิถีภายนอก DHC-1 กระตุ้นภาวะเครียดร่างแหเอนโดพลาสซึมโดยการเพิ่มระดับแคลเซียมทั้งในไซโทซอลและไมโทคอนเดรีย นอกจากนี้ DHC-1 ยังส่งเสริมกระบวนการตายแบบอะพอพโทซิสโดยยับยั้งวิถีสื่อสัญญาณ EGFR/MAPK การใช้ DHC-1 ร่วมกับยาเคมีบาบัด เช่น อิมแมทินิบ โซราฟินิบ และสแมค มิเมติค BV6 มีฤทธิ์เสริมกันในเซลล์ MDA-MB-231 และฤทธิ์แบบบวกในเซลล์ MCF-7 จากการศึกษาทั้งหมดสรุปได้ว่า DHC-1 กระตุ้นการตายอะ-พอพโทซิสในมะเร็งเต้านมมนุษย์ ทั้งเซลล์ MDA-MB-231 และเซลล์ MCF-7 ผ่านทางวิถีภายใน วิถีภายนอกและผ่านทางภาวะเครียดร่างแหเอนโดพลาสซึม นอกจากนี้ยังยับยั้งวิถี EGFR/MAPK ในเซลล์มะเร็งเต้านม MCF-7 ดังนั้น DHC-1 อาจจะใช้เป็นการแพทย์ทางเลือกสาหรับรักษาผู้ป่วยมะเร็งเต้านม การศึกษาผลความเป็นพิษต่อเซลล์ของ DHC-1 และ DHC-2 ในเซลล์ HepG2 พบว่า DHC-1 ยับยั้งการอยู่รอดของเซลล์ HepG2 ที่ 24 ชั่วโมง ขณะที่ DHC-2 ยับยั้งการอยู่รอดของเซลล์ HepG2 ที่เวลา 48 และ 72 ชั่วโมง แต่ไม่มีความเป็นพิษที่เวลา 24 ชั่วโมง เนื่องจาก DHC-2 กระตุ้นได้ทั้งการอยู่รอดและการตายของเซลล์ HepG2 ดังนั้น จึงเลือกสาร DHC-2 เพื่อศึกษากลไกการตายของเซลล์ต่อไป พบว่าระดับของไฮโดรเจน เปอร์ออกไซด์ หรือเปอร์ออกไซด์แรดดิเคิล และซุปเปอร์ออกไซด์แอนไอออนแรดดิเคิลเพิ่มขึ้นในเซลล์ HepG2 หลังจากบ่ม DHC-2 และส่งผลให้เกิดภาวะเครียดออกซิเดชัน DHC-2 กระตุ้นการแสดงออกของโปร-อะพอพโทติคโปรตีน Bax และ Bak ในขณะที่แอนติ-อะพอพโทติคโปรตีน Bcl-xL มีระดับลดลง DHC-2 ทาให้ค่าศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียลดลงและกัมมันตภาพของเอนไซม์ คาสเพส-9, -8 และ -3 เพิ่มขึ้นในเซลล์ เมื่อบ่มเซลล์ HepG2 ด้วย DHC-2 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง DHC-2 ลดระดับโปรตีน Akt ซึ่งทาหน้าที่ควบคุมกระบวนการออ-โตฟากี และเพิ่มการแสดงออกของโปรตีน Atg5 ที่ทาหน้าที่ในกระบวนการออโตฟากี DHC-2 กระตุ้นออโตฟากีเพื่อป้องกันเซลล์ HepG2 ไม่ให้ตาย อย่างไรก็ตามการบ่ม DHC-2 และตัวยับยั้งออโตฟากี ได้แก่ 3-MA ร่วมกันทาให้เซลล์ HepG2 ตาย โดยสรุป DHC-2 กระตุ้นการตายแบบอะพอพโทซิสผ่านทางวิถีภายในและวิถีภายนอกโดยการผลิตสารอนุมูลอิสระ DHC-2 ยังกระตุ้นออโตฟากีเพื่อให้เซลล์ HepG2 อยู่รอด การรักษาโดย DHC-2 และ 3-MA อาจใช้เป็นยาต้านมะเร็งในผู้ป่วยมะเร็งตับ โดยสรุปสารอนุพันธ์ DHCs ทั้งสองมีคุณสมบัติต้านมะเร็งเต้านมหรือมะเร็งตับมนุษย์ผ่านทางการตายแบบอะพอพโทซิสทั้งวิถีภายในและภายนอก อย่างไรก็ตามเซลล์มะเร็งตับ HepG2 เกิดกระบวนการออโตฟากีเพื่อส่งเสริมการอยู่รอดของเซลล์เมื่อบ่มสาร DHC-2 เป็นเวลาสั้น

Chiang Mai University. Library

Address: CHIANG MAI

Email: cmulibref@cmu.ac.th

Name: Bungorn Sripanidkulchai

Role: Chairman

Name: Ratana Banjerdpongchai

Role: Member

Name: Ariyaphong Wongnoppavich

Role: Member

Name: Thanyaluck Phitak

Role: Member

Created: 2020

Modified: 2022-12-16

Issued: 2022-12-16

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: ปริญญาเอก

Descipline: Biochemistry

Grantor: Chiang Mai University

©copyrights Chiang Mai University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	560751021.pdf	5.92 MB

ใช้เวลา

0.027186 วินาที