Screening of spore forming d-lactic acid producing bacteria and its optimization

การคัดกรองแบคทีเรียสร้างสปอร์ที่ผลิตกรดดีแล็กติกและการหาภาวะเหมาะสม

Name: Budsabathip Prasirtsak

LCSH: Bacteria

LCSH: D-lactic acid

Abstract: In this study, isolation, screening, fermentation optimization, and determination of the expression of key enzymes involving in D-lactic acid production were conducted for selection of the novel D-lactic acid isolate with the high yield, productivity, and optical purity. From the screening experiment, the novel isolate, NK26-11T, was obtained. The isolate NK26-11T was a Gram-stain-positive, catalase-positive, facultatively anaerobic, spore-forming, rod-shaped bacterium isolated from soil sample in Thailand. This isolate homofermentatively fermented glucose for D-lactic acid and grew at the wide range of temperature between 20 and 45 °C and the pH of 5-8.5. The cell-wall peptidoglycan of NK26-11T contained meso-diaminopimelic acid. The major respiratory quinone was menaquinone 7 (MK-7), the DNA G+C content was 42.6 mol%, and the major cellular fatty acids were anteiso-C15:0 and anteiso-C17:0. On the basis of 16S rRNA gene sequences analysis, the isolate NK26-11T was closely related to Bacillus solimangrovi JCM 18994T (93.89% 16S rRNA gene sequence similarity), Pullulanibacillus naganoensis LMG 12887T (93.32%), Sporolactobacillus inulinus NRIC 1133T (92.99%), Tuberibacillus calidus JCM 13397T (92.98%) and Thalassobacillus devorans DSM 16966T (˂90.93%). The isolate NK26-11T represents a novel species of a new genus between Bacillus and Sporolactobacillus clusters, for which the name Terrilactibacillus laevilacticus gen. nov., sp. nov. was proposed. The type strain of the type species is NK26-11T (=LMG 27803T =TISTR 2241T =PCU 335T). From the fermentation screening of the selected D-lactic acid producing isolates, it was found that Terrilactibacillus laevilacticus SK5-6 exhibited a good D-lactate production performance (99.27 g/L final lactate titer with 0.90 g/g yield, 1.38 g/L.h, and 99.00% D-enantiomer equivalent) compared with other Sporolactobacillus sp. and Terrilactibabacillus sp. This isolate could ferment a wide range of sugars for D-lactic acid. Unlike the typical D-lactic acid producers, such as catalase negative Sporolactobacillus sp., T. laevilacticus SK5-6 acquired catalase activity; therefore, a 2-phase fermentation was simply employed for D-lactic acid production. Under an aerobic preculture stage, high-cell-density biomass was rapidly obtained as the result of aerobic respiration. At the correct physiological stage (inoculum age) and a proper concentration of biomass (inoculum size) transferred to the fermentation stage, SK5-6 rapidly converted glucose into D-lactic acid under anaerobic conditions resulting in a high final lactic acid titer (102.22 g/L), yield (0.84 g/g), and productivity (2.13 g/L.h) without byproduct formation. It was found that SK5-6 exhibited both fermentation kinetic and expression level of the key enzymes higher than those of S. laevilacticus, a catalase negative D-lactate producer. Low phosphofructokinase activity revealed that glycolysis controlled the apparent D-lactic acid productivity by SK5-6. Increasing the pH during fermentation phase activated the activity of D-LDH (D-lactate dehydrogenase) beyond that of L-LDH, resulting in the high optical purity of D-lactate, while the acidic pH promoted the activities of the kinases in glycolysis. The conversion of L-lactate to D-lactate by isomerase was also observed during fermentation. The findings in this study demonstrated the remarkable characteristics of SK5-6, in particular, a high product yield was obtained without byproduct formation. From the key characteristics of SK5-6, this isolate can be claimed as an industrial D-lactic acid producer.

Abstract: งานวิจัยนี้มุ่งเน้นการคัดแยก คัดกรอง หาภาวะเหมาะสม รวมถึงการแสดงออกของเอนไซม์ที่สำคัญที่เกี่ยวกับการผลิตกรดดีแล็กติกสำหรับแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ที่คัดเลือกได้โดยให้ค่า ผลผลิต อัตราการผลิต และค่าความบริสุทธิ์เชิงแสงของกรดดีแล็กติกที่สูง ผลจากการคัดกรองพบว่า NK26-11T เป็นแบคทีเรียสายพันธุ์ใหม่ แบคทีเรียแกรมบวก สร้างคะตะเลส เจริญได้ทั้งภาวะมีและไม่มีอากาศ สร้างสปอร์ที่รูปร่างทรงแท่ง ที่คัดแยกได้จากดินในประเทศไทย สายพันธุ์นี้สามารถผลิตกรดดีแล็กติกจากกลูโคสแบบโฮโมเฟอร์เมนเททีฟ เจริญที่อุณหภูมิ 20-45 องศาเซลเซียส และพีเอช 5-8.5 ผนังเซลล์มี meso-diaminopimelic acid เป็นองค์ประกอบของเพปทิโดไกลแคน ในกระบวนการหายใจประกอบด้วยเมนาควิโนนชนิด 7 เป็นองค์ประกอบหลัก ดีเอนเอมีองค์ประกอบของกัวนีนกับไซโตซีนหลัก 42.6 เปอร์เซ็นต์โมล และองค์ประกอบกรดไขมันหลักแบบ anteiso-C15:0 และ anteiso-C17:0 ผลจากการวิเคราะห์ลําดับเบสในช่วง 16S rRNA gene พบว่าสายพันธุ์ NK26-11T มีความสัมพันธ์ใกล้เคียง Bacillus solimangrovi JCM 18994T (93.89 เปอร์เซ็นต์) Pullulanibacillus naganoensis LMG 12887T (93.32 เปอร์เซ็นต์) Sporolactobacillus inulinus NRIC 1133T (92.99 เปอร์เซ็นต์) Tuberibacillus calidus JCM 13397T (92.98 เปอร์เซ็นต์) และ Thalassobacillus devorans DSM 16966T (น้อยกว่า 90.93 เปอร์เซ็นต์) สายพันธุ์ NK26-11T เป็นแบคทีเรียสกุลใหม่ที่เป็นตัวแทนระหว่างสกุล Bacillus และ Sporolactobacillus จึงได้เสนอ Terrilactibacillus laevilacticus เป็นแบคทีเรียสกุลใหม่โดยมี NK26-11T เป็นตัวแทนของสกุลและสปีชีส์ (=LMG 27803T =TISTR 2241T =PCU 335T) ผลจากการคัดกรองแบคทีเรียที่ผลิตกรดดีแล็กติกพบว่า Terrilactibacillus laevilacticus SK5-6 มีประสิทธิภาพในการผลิตกรดดีแล็กติก (กรดแล็กติกสุดท้าย 99.27 กรัมต่อลิตร ผลผลิต 0.90 กรัมของกรดดีแล็กติกต่อกรัมของกลูโคสที่ใช้ไป อัตราการผลิต 1.38 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง และค่าความบริสุทธิ์เชิงแสงของกรดดีแล็กติก 99.00 เปอร์เซ็นต์) มากกว่าสปีชีส์ Sporolactobacillus และ Terrilactibacillus ไอโซเลทนี้สามารถผลิตกรดดีแล็กติกจากแหล่งน้ำตาลที่หลากหลาย ซึ่งตรงข้ามกับสายพันธุ์ Sporolactobacillus ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่ผลิตกรดดีแล็กติกและไม่ผลิตคะตะเลส จากคุณลักษณะของ T. laevilacticus SK5-6 ที่ผลิตคะตะเลสได้จึงแบ่งการทดลองเป็นสองขั้นตอนสำหรับการผลิตกรดดีแล็กติก ขั้นตอนการเลี้ยงหัวเชื้อบ่มในภาวะมีอากาศส่งผลให้ได้มวลเซลล์ปริมาณมากในระยะเวลาที่สั้น การเตรียมหัวเชื้อในระยะที่เหมาะสม (อายุหัวเชื้อ) และความเข้มข้นมวลเซลล์ (ปริมาณหัวเชื้อ) ถ่ายเทสู่กระบวนการหมัก พบว่าสายพันธุ์ SK5-6 สามารถใช้กลูโคสเปลี่ยนเป็นกรดดีแล็กติกได้อย่างรวดเร็วภายใต้ภาวะไร้อากาศส่งผลให้ได้กรดดีแล็กติกสุดท้ายในปริมาณที่สูง (102.22 กรัมต่อลิตร) ผลผลิต (0.84 กรัมต่อกรัม) อัตราการผลิต (2.13 กรัมต่อลิตรต่อชั่วโมง) และไม่เกิดผลิตภัณฑ์ข้างเคียง นอกจากนี้ยังพบว่าสายพันธุ์ SK5-6 แสดงผลจลนพลศาสตร์ของการหมัก และการแสดงออกของเอนไซม์มากกว่า S. laevilacticus ซึ่งเป็นแบคทีเรียผลิตกรดดีแล็กติกที่ไม่สร้างคะตะเลส ฟอสโฟฟรุกโตไคเนสแสดงกิจกรรมของเอนไซม์ในปริมาณที่ต่ำซึ่งเกี่ยวข้องกับวิถีไกลโคไลซิสส่งผลต่ออัตราการผลิตกรดดีแล็กติกของสายพันธุ์ SK5-6 ในระหว่างกระบวนการหมักกรดแล็กติกพบว่าเมื่อพีเอชเพิ่มขึ้นส่งผลกระตุ้นการทำงานของดีแล็กเทตดีไฮโดรจีเนส มากกว่าแอลแล็กเทตดีไฮโดรจีเนส ส่งผลให้ค่าความบริสุทธิ์เชิงแสงของกรดดีแล็กติกสูงขึ้น ในขณะที่พีเอชค่าความเป็นกรดส่งผลต่อการทำงานของไคเนสในวิถีไกลโคไลซิส การเกิดไอโซเมอร์ไรเซชั่นจากการเปลี่ยนกรดแอลแล็กเทตเป็นกรดดีแล็กเทตโดยไอโซเมอเรส สามารถพบในระหว่างการหมักกรดแล็กติก จากการศึกษาครั้งนี้พบว่าคุณลักษณะที่โดดเด่นของสายพันธุ์ SK5-6 โดยเฉพาะผลผลิตที่สูง และไม่เกิดผลิตภัณฑ์ข้างเคียง จากคุณลักษณะที่สำคัญสามารถกล่าวได้ว่าเป็นแบคทีเรียที่เหมาะสมกับอุตสาหกรรมการหมักกรดดีแล็กติก

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Nuttha Thongchul

Role: advisor

Name: Somboon Tanasupawat

Role: advisor

Created: 2017

Modified: 2021-05-08

Issued: 2021-05-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/64934

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5572876123[1].pdf	3.68 MB	13	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.027305 วินาที