การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของอะซีทิลเอสเทอเรสจาก Streptomyces sp. PC22

Purification and characterization of acetyl esterase from Streptomyces sp. PC22

Name: วัชรี ชุณห์กุล

ThaSH: สเตรปโตมัยซิส

ThaSH: อะเซทิลีน

ThaSH: เอสเทอเรส

Abstract: งานวิจัยนี้ศึกษาการทําอะซีทิลเอสเทอเรสซึ่งเป็นหนึ่งในเอนไซม์ย่อยสายกิ่งของไซแลนให้บริสุทธิ์จาก Streptomyces sp. PC22 ที่เลี้ยงในอาหารเหลวที่มีไซแลนจากไม้เบิร์ชเป็นแหล่งคาร์บอน โดยการตกตะกอนลําดับส่วนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตความเข้มข้ม 30-90 เปอร์เซ็นต์ ตามด้วยทําคอลัมน์โครมาโทกราฟีบนแมคโคร-เพรบ ดีอีเออี บิวทิล ไฮโดรโฟบิค อินเตอร์แอคชัน และไฮดรอกซีอะปาไทด์ ได้เอนไซม์ที่มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้นประมาณ 51 เท่า เหลือแอคติวิตอยู่ 7.33 เปอร์เซ็นต์ จากการวิเคราะห์น้ําหนักโมเลกุลโดยวิธีเจลฟิลเตรชันพบว่าเอนไซม์นี้มีน้ำหนัก โมเลกุลประมาณ 155 กิโลดาลตัน และเมื่อวิเคราะห์โดยวิธีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟตพอลิอะคริลา ไมด์เจลอีเลคโทรโฟรซิสพบว่าเอนไซม์ประกอบด้วย 4 หน่วยย่อยที่มีน้ําหนักโมเลกุลเท่ากันคือ 38 กิโลดาลตัน จากการศึกษาสมบัติของอะซีทิลเอสเทอเรสบริสุทธิ์พบว่าเอนไซม์มีอุณหภูมิและความ เป็นกรดด่างที่เหมาะสมต่อการทํางาน คือ 50 องศาเซลเซียส และ 6.5 ตามลําดับ เอนไซม์มีความ เสถียรต่ออุณหภูมิสูงถึง 55 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที และเสถียรต่อความเป็นกรดด่างใน ช่วงกว้างตั้งแต่ 5.0-9.0 ค่า Km ต่อพารา-ไนโตรฟีนิล อะซีเตท เท่ากับ 0.43 มิลลิโมลาร์ เอนไซม์ถูกยับยั้งอย่างรุนแรงด้วยอิออนของปรอท ทองแดง และสังกะสี นอกจากนี้ยังถูกยับยั้งด้วยฟินิลเมธิล ซัลโฟนิลฟลูออไรด์แสดงว่ากรดอะมิโนเซรีนเกี่ยวข้องกับบริเวณเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ จากการตรวจสอบแอคติวิตีข้างเคียงของอะซีทิลเอสเทอเรส พบว่าเอนไซม์มีแอคติวิตีของไซแลเนสและแอลฟา-แอล-อะราบิโนฟิวราโนสิเดสต่ำมาก และไม่มีแอคติวิตีของบีตา-ไซโลสิเดสและเซลลูเลส ผลการใช้งานร่วมกับเอนไซม์อื่นพบว่าอะซีทิลเอสเทอเรสสามารถทํางานร่วมกับไซแลเนส ∥ จาก Streptomyces s PC22 และบีตา-ไซโลสิเดสจาก Streptomyces sp. CH7 ในการเพิ่ม ประสิทธิภาพการย่อยสลายไซแลนจากไม้เบิร์ชได้ โดยเมื่อบ่มอะชีทิลเอสเทอเรสร่วมกับไซแลนเนส ∥ ได้ปริมาณน้ำตาลรีดิวซ์เพิ่มขึ้นประมาณ 10 เปอร์เซ็นต์ แต่เมื่อบ่มปฏิกิริยาร่วมกันทั้งอะซีทิลเอส เทอเรส ไซแลเนส ∥ และบีตา-ไซโลสิเดส พบว่าจะได้น้ําตาลรีดิวซ์เพิ่มขึ้นสูงสุด 46 เปอร์เซ็นต์

Abstract: Acetyl esterase, one of xylan - debranching enzymes, was purified from the culture filtrate of Streptomyces sp. PC22 grown in liquid medium containing birchwood xylan as a carbon source. The enzyme was purified to approximately 51 folds with a recovery yield of 7.33% by fractionation with 30-90% saturation of ammonium sulfate followed by consecutive column chromatography on Macro-prep DEAE, butyl hydrophobic interaction and hydroxyapatite, respectively. The apparent molecular weight of the purified enzyme was 155 kDa as estimated by gel filtration and revealed four identical subunits of 38 kDa estimated by SDS-PAGE. The enzyme had temperature and pH optima of 50°C and 6.5, respectively. It was stable to temperature up to 55°C for 30 min and to a broad range of pH from 5.0-9.0. The Km value of the enzyme for p-nitrophenyl acetate was 0.43 mM. Metal ions including Hg²⁺, Cu²⁺ and Zn²⁺ markedly inhibited the enzyme activity and its activity was inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride indicating serine residue involved in catalytic mechanism. The purified enzyme barely showed α-L-arabinofuranosidase and xylanase activities and did not exhibit any β-xylosidase and cellulase acitivities. Its potential application was evaluated and showed cooperative action with xylanase ∥ from Streptomyces sp. PC22 and β-xylosidase from Streptomyces sp. CH7 on birchwood xylan hydrolysis. When combined with xylanase ∥, it increased the release of reducing sugar to about 10% of that of xylanase ∥ alone, whereas about 46% increase in reducing sugars liberated was obtained with the combination of xylanase ∥ and β-xylosidase.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: ไพเราะ ปิ่นพานิชการ

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2548

Modified: 2564-03-14

Issued: 2564-03-14

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/67439

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Watcharee_ch.pdf	9.28 MB

ใช้เวลา

0.02951 วินาที