Study on Substrate-Binding Site of Family 10 and 11 Xylanases from Bacillus firm us K -1 by Molecular Modeling and Production of Xylooligosaccharides by the Family 11 Xylanase

การศึกษา substrate-binding site ของไซลาเนสแฟมิลี 10 และ 11 จากเชื้อ Bacillus Firmus K-1 ด้วยวิธี Molecular modeling และการผลิตไซโลโอลิโแว็กคาไรค์โดยไซลาเนสแฟมิลี 11

Name: Pattraporn Jommuengbout

Name: พัตราพร จอมเมืองบุตร

keyword: Agricultural Waste

Abstract: The objective of this study is to generate the three-dimensional structure (3D structure) of family 10 and 11 xylanases (Xyn lOA and Xyn 11 A) from Bacillus firmus K-1 by homology modeling and to investigate the substrate-binding site and secondary xylanbinding site of XyniiA by molecular docking whereas the substrate-binding site of Xynl0A was conducted by molecular dynamics simulations. The production of xylooligosaccharides by the Xyn11A was also investigated. The 3D structure of XynllA a family 11 xylanase from Bacillusfirmus K-l, was obtained through homology modeling using the X-ray structure of Bacillus circulans (lBVV) xylanase as a template. The result showed that the 3D structure ofXynllA had a shape as a "closed right hand". It contains 14 p-sheets and 1 a-helix. The catalytic sites of Xyn11A are Glu78 and Glu171. which are located opposite to each other in an open cleft and reach into this cleft. Glu78, which is nuc1eophile, holds in place by interaction to Gln126, Tyr69 and Tyr80, while Glu171, which is acid/base catalyst forms hydrogen bond with only Asn35. The same Root mean square deviation (RMSD) which was obtained from superposition backbone structure and each atom between XyniiA and IBVV were 0.329 A. These results show that 3D structure from homology modeling is correctable and believable. This method is an alternative for determination of the 3D structure of enzyme within a short time. To study the substrate-binding site of Xyn11A, six xylooligosaccharides, xylobiose to xyloheptaose (X2-X7), were docked into the active site of XynllA by molecular docking. Based on the docked energy and estimated free energy of binding combined with modeled enzyme-substrate complexes, the substrate-binding site of XynllA probably contained six subsites, defined as -3, -2. 1, +1, +2 and +3. Focused on possible stacking interaction presented seven aromatic residues, that played an important role in six subsites of XynllA such as Tyr165 (-3), Trp9 and Tyr69 (-2). Tyr80 (-1), Tyr65 (+1), Tyr88 (+2) and Tyr173 (+3). The bond-cleavage positions showed that X2 and X3 did not bind at the cleft (subsites -1 and + 1) of Xyn11A. Related to the experiment, the end products of larchwood xylan hydrolysis by purified XynllA were X2 and X3. X2 and X3 acted as the end product inhibitors of Xyn11A. Xyn11A could bind and hydrolyze insoluble xylans and agricultural wastes effectively. The rigid docking of xylooligosaccharides (X2-X6) into the overall Xyn11A structure showed that xylooligosaccharides bound not only at binding site of active site but also at the possible secondary xylan-binding site (XBS) of Xyn11A. According to the %frequency and the lowest docked energy, the XBS preferred to bind with long-chain substrate. The structural feature of XBS was a shallow groove presenting particularly solvent-exposed residues located at the knuckles of the close-right hand structure. Comparing to eleven residues in XBS of B. circulans family 11 xylanase (BcX) that bound to X4, seven of nine residues in XBS of XynllA showed sequence identity of 63.64% with that of the BcX. Moreover, when XynIlA bound to X6, four residues, Asn 180, Trp58, Thr29 and Arg 178, were observed at subsites 5 and 6 of XBS. This finding supported to clearly explain that the XBS within the single-catalytic domain of the Xyn11A, lacking of carbohydrate-binding module (CBM) played an important role for facilitating the Xyn11A in efficiently binding and hydrolyzing insoluble xylan as same as CBMs of the modular enzymes. According to study of kinetic parameters of purified Xyn11A on soluble xylans, the Vmax/Km determined with larchwood xylan (LWX) was approximately lO-fold and 20.8- fold higher than birchwood (BWX) and oat spelt (OSX) xylans, respectively. This result indicated that Xyn11A prefers to hydrolyze long chain with low substituted structure of LWX. Purified Xyn11A had hydrolytic ability toward a variety of xylans, including xylan-containing agricultural wastes. Series of xylooligosaccharides (XOs) produced from hydrolysis of insoluble LWX. BWX and corn husk by puritied Xyn11A were X2- X6, whereas those of corn cob, sugarcane bagasse, rice straw and rice husk were mainly X2-X4. These results suggested that the Xyn11A was the effective endoxylanase for XOs production from low-cost agricultural wastes, and obtained XOs were valued and benetlcial to related-food industries. The 3D structure of Xyn10A, a family 10 xylanase from B. firmus K-1. was obtained through homology modeling using X-ray structure of xylanase from Bacillus sp. strain NG-27 as a template. The RMSD of backbone atoms between the X-ray and homology modeled structures was 0.8 A. Binding of xylopentaose (X5) to the Xyn10A was investigated using molecular dynamics simulations via comparison of the total energy, RMSD of C-alpha atom and root mean square fluctuation (RMSF) of free and complex forms of Xyn10A. In the reactive Xyn10A-X5 conformation in which the two catalytic sites, Glu149 and Glu255 are precisely positioned for the catalytic reaction. the -1 sugar moiety of the X5 adopted a 1C4 chair conformation for the Xyn10A. According to the RMSF of Xyn10A, 13 amino acid residues in active site of complex form showed more flexibility than those of free form. The results suggested that they may implicate in binding to X5 at sub sites -3 to +2 of substrate-binding site through hydrogen bonding and stacking interactions. Furthermore, the RMSF of X5 revealed that the substrate binding site of Xyn10A was more specific to three middle xylose moieties than two terminal xylose moieties.

Abstract: วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อสร้างโครงสร้าง 3 มิติของไซลาเนสแฟมิลี 10 และ 11 (Xyn10A และ Xyn11A) จากเชื้อ Bacillus Firmus K-1 ด้วยวิธี homology modeling แบะศึกษาบริเวณ subtrate-binding site และ secondary xylan-binding site ของ Xyn11A ด้วยวิธี molecular docking และบริเวณ substrate- binding site ของ Xyn10A ด้วยวิธี Molecular Dynamics simulations นอกจากนี้ยังศึกษาการผลิตไซโล โอลิโอแซ็กคาไรดโดย Xyn11A โครงสร้าง 3 มิติของ Xyn11A ซึ่งเป็นไซลาเนสแฟมิลี 11 จาก Bacillusfirmus K-1 ทำการสร้างด้วยวิธี homology modelmg โดยใช้โครงสร้าง 3 มิติของไซลาเนสจาก Bacillus circulans (1BVV) ที่ได้จากวิธี X-ray crystallography เป็นแม่แบบ พบว่าโครงสร้าง 3 มิติของ Xyn11A มีลักษณะคล้ายกับ "close right hand" ซึ่งประกอบด้วย 14 p-sheets และ 1 a-helix โดยที Glu78 แบะ Glu171 เป็น catalytic site ที่อยู่ใน ทิศทางตรงกันข้ามและยื่นส่วนของ side chain เข้าไปภายใน cleft มีบทบาทเป็น nucleophile โดยสร้าง พันธะไฮโดรเจนกับ Gln126. Tyr69 และ Tyr80 ขณะที่ Glul71เป็น acid/base catalyst ที่สร้างพันธะ ไฮโดรเจนกับ Asn35 เพียงตำแหน่งเดียว เมื่อพิจารณาค่า Root mean square deviation (RMSD) ที่ได้ จากการ superposition โครงสร้างหลักและแต่ละอะตอมภายในโครงสร้างของ Xyn IIA กับ lBVV พบว่ามีค่าเท่ากันคือ 0.329 A? แสดงให้เห็นว่าโครงสร้าง 3 มิติ ที่หาได้จากวิธี homology modeling มีความถูกต้องและน่าเชื่อถือ ซึ่งเป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการหาโครงสร้าง 3 มิติของเอนไซม์ที่ใช้ ระยะเวลาน้อย การศึกษาบริเวณ substrate-binding ของ Xyn11A ทำโดยการ Dock ไซโลโอลิโกแซ็กคาไรด์จำนวน 6 ขนาด ได้แก่ xylobiose ถึง xyloheptaose (X1-X7 ) เข้าไปยึดจับบริเวณ active site ด้วยวิธี molecular docking เมื่อพิจารณาค่า docked energy และ estimated free energy of binding ร่วมกับการศึกษารูปแบบ ของการเข้ายึดจับกันระหว่างเอนไซม์กับสับสเตรท พบว่า substrate-binding site ของ Xyn11A น่าจะมี ทั้งหมด 6 Subsite ซึ่งประกอบด้วย subsite-3, -2, -1, +1, +2 และ +3 จากการศึกษาชนิดและตำแหน่งของ กรดอะมิโนที่มีบทบาทสำคัญในการเข้ายึดจับกับสับสเตรทในแต่ละ subsite โดยพิจารณาที่ความเป็นไปได้ ในการเกิด stacking interaction พบว่ามีทั้งหมด 6 ชนิด ได้แก่ Tyrl65 (-3), Trp9 และ Tyr69 (-2), Tyr80 (-1), Tyr65 (+1), Tyr88 ) และ Tyr173 (-3) ผลจากการศึกษาตำแหน่งในการตัดสับสเตรทของเอนไซม์ (bond - cleavage position) แสดงให้เห็นว่า X และ X3 ไม่ยึดจับบริเวณ cleft (ระหว่าง susite -1 และ +1) ของ Xny11A ซึ่งสอดคล้องกับผลที่ได้จากการทดลองที่พบว่าผลิตภัณฑ์สุดท้ายที่ได้จากการย่อย larchwood xylan ด้วย Xyn11A บริสุทธิ์ คือ X2 และ X3 นอกจากนี้ยังพบว่า X2 และ X3 ทำหน้าที่เป็น end product inhibitor ของ Xyn11A Xyn11A สามารถยึดจับและย่อยสลายไซแลนที่ไท่ละลายน้ำและวัสดุเหลือทิ้งทางการเกษตรได้ดีมากจากการ dock ไซโลโอลิโกแซ็กคาไรด์ (X2-X6) แบบ rigid เข้าไปในโครงสร้างของ Xyn11A พบว่า ไซโลโอลิโกแซ็กคาไรด์สามารถ เข้ายึดจับกับ binding site ของ Xyn11A ทั้งในบริเวณ active site และบริเวณที่น่าจะเป็น secondary xylan-binding site (XBS) เมื่อพิจารณา%frequency และค่า lowest doched energy พบว่า XBS ชอบยึดจับกับสับสเตรทที่มีสายยาว จากการศึกษาลักษณะโครงสร้างของบริเวณ XBS พบว่ามีลักษณะเป็นร่องตื้นๆ ส่วนใหญ่ประกอบด้วย solvent-exposed residue ซึ่งอยู่ในบริเวณที่คล้ายกับข้อนิ้ว (knuckle) ของโครงสร้างที่มีลักษณะคล้าย close-right hand เมื่อเปรียบเทียบ กรดอะมิโนในบริเวณ XBS ของไซลาเนสแฟมิลี 11 จากเชื้อ Bacillus circulans (BcX) กับ Xyn11A ที่ยึดจับกับ xylotetraose พบว่ากรดอะมิโนในบริเวณ XBS ของ BcX ที่ยึดจับกับ xylotetraose มีทั้งหมด 11 ชนิด ซึ่งมีความเหมือนกันกับกรดอะมิโน ของ Xyn11A 7 ชนิด จากทั้งหมด 9 ชนิด โดยคิดเป็น 63.64% นอกจากนี้เมื่อ Xyn11A ยึดจับกับ X6 พบกรดอะมิโนที่เกี่ยว ข้องในการยึดจับสับสเตรทในบริเวณ XBS เพิ่มขึ้นอีก 4 ชนิด ได้แก่ Asn180, TrpS8. Thr29 และ Argl78 ซึ่งอยู่ใน subsites 5 และ 6 ของ XBS การค้นพบนี้ช่วยอธิบายได้ว่า บริเวณ XBS ที่อยู่ภายในโครงสร้างที่มีเพียง catalytic domain เดียวของ Xyn11A ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ไม่มีบริเวณ carbohydrate-binding module (CBM) มีส่วนสำคัญที่ช่วยให้ Xyn11A สามารถยึดจับและย่อยไซแลนที่ไม่ละลายน้ำได้ดีเทียบเท่ากับพวก modular enzyme ที่มีบริเวณ CBM จากการศึกษาค่าจลน์ศาสตร์ของ XynllA บริสุทธิ์ต่อการย่อยไซแลนที่ละลายน้ำ พบว่าค่า V? /K? ของ larchwood xylan (LWX) มากว่า birchwood xylan (BWX) และ oat spelt xylan (OSX) ประมาณ 10 และ 20.8 เท่า ตามลำดับ จากผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่า XynllA ชอบย่อย LWX ซึ่งเป็นไซแลนที่มีสายยาวและมีกิ่งก้านน้อย โดย XynllA บริสุทธิ์สามารถย่อยไซแลนต่างๆ รวมไป ถึงไซแลนที่เป็นองค์ประกอบในวัสดุเหลือทิ้งทางการเกษตรได้ดี ไซโลโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่ผลิตได้ จากการย่อย insoluble LWX, BWX และเปลือกข้าวโพดโดย XynllA บริสุทธิ์ คือ X2 - X6 ขณะที่ ผลิตภัณฑ์หลักที่ได้จากซังข้าวโพด ชานอ้อย ฟางข้าว และแกลบ คือ X2-X4 ข้อมูลดังกล่าวแสดงให้ เห็นว่า XynllA เป็น endoxylanase ที่มีประสิทธิภาพในการผลิตไซโลโอลิโกแซ็กคาไรด์จากวัสดุ เหลือทิ้งทางการเกษตรที่มีราคาถูก เพื่อให้ได้ไซโลโอลิแซ็กคาไรด์ที่มีมูลค่าและมีประโยชน์ต่อการ นำไปใช้ในอุตสาหกรรมอาหารต่าง ๆ โครงสร้าง 3 มิติของ Xyn10A ซึ่งเป็นไซลาเนสแฟมิลี 10 จาก B. firmus K-1 ถูกสร้างด้วยวิธี homology modeling โดยใช้โครงสร้าง 3 มิติของไซลาเนสจาก Bacillus sp. strain NG-27 (2F8Q)ที่ สร้างด้วยวิธี X-ray crystallography เป็นแม่แบบ เมื่อพิจารณาค่า Root mean square deviation (RMSD) ที่ได้จากการ superposition โครงสร้างหลักและแต่ละอะตอมภายในโครงสร้างระหว่าง โครงสร้างที่ได้จากวิธี X-ray crystallography และ homology modeling พบว่ามีค่าเท่ากัน คือ 0.8 A การยึดจับกันระหว่าง xylopentaose (X5) กับ Xyn10A ถูกศึกษาโดยการเปรียบเทียบค่า total energy. RMSD ของ Ca atom และ root mean square fluctuation (RMSF) ระหว่าง Xyn10A ที่อยู่ในรูปอิสระ (free form) กับ Xyn10A ที่ยึดจับกับสับสเตรท (complex form) ด้วยวิธี molecular dynamics simulations เมื่อพิจารณาลักษณะโครงสร้างของ X5 ที่ยึดจับกับ Xyn10A ซึงมี glutamic acid 2 ตำแหน่ง ได้แก Glu149 และ Glu 255 ทำหน้าที่เป็น catalytic site พบว่าโมเลกุลของน้ำตาลไซโลสของ X5 ขณะที่ยึดจับกับ Xyn10A ในตำแหน่งที่ subsite- 1 ถูกเปลี่ยนโครงสร้างให้อยู่ในรูปของ C chair conformation จากการศึกษาค่า RMSF ของ Xyn10A โดยเปรียบเทียบการเคลื่อนไหวของกรด อะมิโนระหว่าง complex form และ free form พบกรดอะมิโนจำนวน 13 ชนิดในบริเวณ active site ของ complex form ที่มีการเคลื่อนไหวมากกว่าใน free form ผลการทดลองนี้แสดงให้เห็นว่ากรดอะ มิโนเหล่านี้น่าจะเกี่ยวข้องกับการยึดจับกับ X5 ในบริเวณ substrate-binding site ด้วยพันธะไฮโดรเจน และ stacking interaction ที่ subsites -3 ถึง +2 นอกจากนี้เมื่อพิจารณาค่า RMSE ของ X5 พบว่า substrate binding site ของ Xyn10A มีความจำเพาะต่อน้ำตาลไซโลส 3 โมเลกุลที่อยู่ตรงกลางมากกว่า น้ำตาลไซโลส 2 โมเลกุล ซึ่งอยู่ด้านปลายทั้ง 2 ข้าง

King Mongkut's University of Technology Thonburi. KMUTT Library.

Address: BANGKOK

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: Khanok Ratanakhanokchai

Role: Advisor

Created: 2553-09-23

Modified: 2025-01-27

Issued: 2010-09-23

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: BCT226

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemical Technology

Grantor: King Mongkut's University of Technology Thonburi

©copyrights King Mongkut's University of Technology Thonburi

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	BCT226.pdf	1.8 MB	39	2023-03-13 00:30:18
2	BCT226ab.pdf	316.37 KB	24	2023-03-13 00:28:12

ใช้เวลา

0.035969 วินาที