Taxonomy of lipase producing moderately halophilic bacteria

อนุกรมวิธานของแบคทีเรียชอบเค็มปานกลางที่ผลิตไลเปส

Name: Rungsima Daroonpunt

Abstract: One hundred and thirty eight of lipase-producing halophilic bacteria from fish sauce, fermented fish, shrimp paste and Poo-chem collected from the factories and the markets were isolated. Seventy isolates showed lipolytic activity on lipolytic agar using Tween (20, 40, 60 or 80) as substrates. Thirty-six isolates that showed more than 1 unit/ml of lipase activity in liquid medium were collected for identification. On the basis of phenotypic characteristics and 16S rRNA sequences, thirty strains were identified as Virgibacillus dokdonensis (3 isolates), Virgibacillus alimentarius (1 isolate), Virgibacillus halodenitrificans (2 isolates), Lentibacillus juripiscarius (1 isolate), Oceanobacillus iheyensis (1 isolate), Alkalibacillus almallahensis (1 isolate), Halobacillus trueperi (1 isolate), Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum (1 isolate), Bacillus altitudinis (1 isolate), Bacillus seohaeanensis (1 isolate), Bacillus zhangzhouensis (1 isolate), Corynebacterium falsenii (2 isolates), Corynebacterium variabile (2 isolates), Brevibacterium sediminis (2 isolate), Proteus penneri (1 isolate), Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis (2 isolates), Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (1 isolate), Staphylococcus nepalensis (1 isolate), Salinicoccus salsiraiae (1 isolate), Salinicoccus siamensis (3 isolates), Vibrio alginolyticus (4 isolates), Shewanella indica (1 isolate). Bacillus strain NR1-3-2 isolated from fish sauce and Virgibacillus strain KN3-8-4 isolated from shrimp paste (ka-pi) were novel species based on polyphasic taxonomy. Strain NR1-3-2 contained anteiso-C15:0, iso-C15:0 and anteiso-C17:0 as major cellular fatty acids and had diphosphatidyl glycerol (DPG), phosphatidyl glycerol (PG) and one glycolipid as polar lipids. DNA G+C content was 44.2 mol%. The 16S rDNA sequence analyses indicated that strain NR1-3-2 highest similarity with Bacillus iranensis DSM 23995T (97.4%). Strain NR1-3-2T exhibited low DNA -DNA relatedness (39.8%) with Bacillus iranensis DSM 23995Tand was proposed as Bacillus piscicola sp. nov. Strain KN3-8-4 contained anteiso-C15:0, anteiso-C17:0 and iso-C15:0 as major cellular fatty acids and had PG, DPG, two unknown phospholipids and one glycolipid as polar lipids. The DNA G+C content was 43.58 mol%.The 16S rDNA sequence analyses indicated that strain KN3-8-4 closely related to Virgibacillus olivae JCM 30551T (97.85%). This strain showed low DNA -DNA relatedness with Virgibacillus olivae JCM 30551T (28.8%) and was proposed as Virgibacillus kapii sp. nov. Strain KN3-8-4 selected for lipase purification produced the maximum lipase at stationary phase and could be achieved when casamino acids was replaced by 0.5% palm oil (w/v) in a modified JCM no. 377 medium with 1% NaCl (w/v), pH 8.5 and incubated at 40°C for 36 h. The KN3-8-4 lipase was purified by cold acetone precipitation, gel filtration and anion exchange chromatography with 18.66-fold purification. The purified lipase from KN3-8-4 was monomeric protein with the molecular mass of about 19.5 kDa by gel filtration and 19 kDa by SDS-PAGE. The enzyme had a maximal activity in the presence of 7% w/v NaCl, pH 8.0 at 40°C. The enzyme exhibited a variable specificity activity towards various p-nitrophenyl esters especially p-nitrophenyl butyrate (C4).

Abstract: ในการคัดแยกสายพันธุ์แบคทีเรียชอบเค็มปานกลางจำนวน 138 ไอโซเลต ที่สร้างไลเปสจากตัวอย่างน้ำปลา, ผลิตภัณฑ์ปลาหมัก ปูเค็ม และกะปิ ที่เก็บจากโรงงานและตลาด พบว่าแบคทีเรียชอบเค็ม 70 ไอโซเลตมีกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปส บนอาหารแข็งที่มี Tween 20, 40, 60 หรือ 80 เป็นซับสเตรท เมื่อนำมาศึกษาในอาหารเหลว (complex medium) คัดเลือกแบคทีเรียชอบเค็มจำนวน 36 ไอโซเลตที่แสดงผลของกิจกรรมของเอนไซม์ไลเปสสูงกว่า 1 ยูนิตต่อมิลลิลิตรในอาหารเหลวเพื่อพิสูจน์เอกลักษณ์โดยอาศัยการศึกษาลักษณะทางฟีโนไทป์และการวิเคราะห์ลำดับในช่วง 16S rRNA สามารถแบ่งแบคทีเรียออกเป็น 24 กลุ่มและพิสูจน์เอกลักษณ์ได้เป็น Virgibacillus dokdonensis (3 สายพันธุ์) Virgibacillus alimentarius (1 สายพันธุ์) Virgibacillus halodenitrificans (2 สายพันธุ์) Lentibacillus juripiscarius (1 สายพันธุ์) Oceanobacillus iheyensis (1 สายพันธุ์) Alkalibacillus almallahensis (1 สายพันธุ์) Halobacillus trueperi (1 สายพันธุ์) Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum (1 สายพันธุ์) Bacillus altitudinis (1 สายพันธุ์) Bacillus seohaeanensis (1 สายพันธุ์) Bacillus zhangzhouensis (1 สายพันธุ์) Corynebacterium falsenii (2 สายพันธุ์) Corynebacterium variabile (2 สายพันธุ์) Brevibacterium sediminis (2 สายพันธุ์) Proteus penneri (1 สายพันธุ์) Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis (2 สายพันธุ์) Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (1 สายพันธุ์) Staphylococcus nepalensis (1 สายพันธุ์) Salinicoccus salsiraiae (1 สายพันธุ์) Salinicoccus siamensis (3 สายพันธุ์) Vibrio alginolyticus (4 สายพันธุ์) Shewanella indica (1 สายพันธุ์) Bacillus สายพันธุ์ NR1-3-2 จากน้ำปลาและ Virgibacillus สายพันธุ์ KN3-8-4 จากกะปิเป็นแบคทีเรียสปิชีส์ใหม่จากผลการศึกษาลักษณะอนุกรมวิธานแบบโพลีฟาสิก สายพันธุ์ NR1-3-2 มีกรดไขมันเป็น anteiso-C15:0, iso-C15:0 และ anteiso-C17:0 และมี polar lipid เป็น diphosphatidyl glycerol, phosphatidyl glycerol และ glycolipid มีปริมาณ G+C ของ DNA เป็น 44.2 โมลเปอร์เซ็นต์ ผลการวิเคราะห์ลำดับเบสในช่วง 16S rDNA ใกล้เคียงกับ Bacillus iranensis DSM 23995T (97.4 เปอร์เซ็นต์) และมีความคล้ายคลึงของ DNA ต่ำเทียบกับ Bacillus iranensis DSM 23995T (39.8%) จึงเสนอเป็นแบคทีเรียสปิชีส์ใหม่ชื่อว่า Bacillus piscicola ส่วนสายพันธุ์ KN3-8-4 มีกรดไขมันเป็น anteiso-C15:0, anteiso-C17:0 และ iso-C15:0 และมี polar lipid เป็น phosphatidyl glycerol, diphosphatidyl glycerol, unknown phospholipids และ glycolipid ปริมาณ G+C ของ DNA เป็น 43.58 โมลเปอร์เซ็นต์ ผลการวิเคราะห์ลำดับเบสในช่วง 16S rDNA ใกล้เคียงกับ Virgibacillus olivae JCM 30551T (97.85 เปอร์เซ็นต์) และมีความคล้ายคลึงของ DNA ต่ำเทียบกับ Virgibacillus olivae JCM 30551T (28.8%) จึงเสนอเป็นแบคทีเรียสปิชีส์ใหม่ชื่อว่า Virgibacillus kapii การศึกษาไลเปสจากสายพันธุ์ KN3-8-4 พบว่าสามารถสร้างไลเปสสูงสุดในระยะ stationary phase เมื่อเลี้ยงในอาหารดัดแปลง JCM no. 377ที่ความเข้มข้นเกลือ 1 เปอร์เซ็นต์ โดยแทนที่ casamino acid ด้วยน้ำมันปาล์ม 0.5 เปอร์เซ็นต์ พีเอช 8.5 และอุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ทำให้เอนไซม์ไลเปสบริสุทธิ์โดยเทคนิค acetone precipitation, gel filtration และ anion exchange chromatography พบว่าไลเปสที่ได้ความบริสุทธิ์สูงขึ้น 18.66 เท่า และลักษณะสมบัติของไลเปสบริสุทธิ์ที่แยกได้คำนวณจาก gel filtration และ SDS-PAGE พบว่ามีน้ำหนักโมเลกุล 19.5 และ 19 kDa ตามลำดับ และทำปฏิกิริยาได้ดีที่สุดในสภาวะที่มีความเข้มข้นเกลือ 7 เปอร์เซ็นต์ พีเอช 8.0 และที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส นอกจากนี้เอนไซม์ยังมีความจําเพาะเจาะจงต่อสารตั้งต้นของ p-nitrophenyl esters หลายตัว โดยเฉพาะอย่างยิ่ง p-nitrophenyl butyrate ความจําเพาะเจาะจงสูงสุด

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Somboon Tanasuoawat

Role: Advisor

Email : Somboon.T@Chula.ac.th

Name: Wonnop Vissessanguan

Role: Advisor

Created: 2016

Modified: 2020-08-12

Issued: 2020-08-12

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/63055

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Pharmaceutical Chemistry and Natural Products

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5576452433[1].pdf	3.39 MB	1	2024-11-04 15:48:57

ใช้เวลา

0.025291 วินาที