Preparation of Biologically Active Silk Protein for Cell Culture Supplement

การเตรียมโปรตีนที่เป็นสารออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากรังไหมเพื่อใช้เติมในการเลี้ยงเซลล์

Name: Pawan Mongkolprasit

keyword: CHO Cell Propagation

Abstract: Silk filaments produced by silk worms Bombyx mori typically consists of two fibroin filaments joined together by sericin, a gum-like material. Fibroin and sericin have recently gained considerable attention in several disciplines such as biotechnology and biomaterials requiring starting materials of uniform qualities. Fibroin and sericin, a biologically active natural protein extracted from silk cocoon, are of wide molecular weight range displaying different chemical characteristics. The properties and efficiency of sericin and fibroin depended on degumming reagents and conditions. In this study, silk cocoons were degurnrned using alkaline solution (Na2CO3), alcalase and citric acid including heat treatment by autoclaving while Ajisawa's reagent were used to dissolve both fibroin and whole yellow silk cocoons, respectively. Response Surface Methodology (RSM) was employed to optimize sericin removal using alkaline and citric acid. RSM results show that treating with 0.9% Na2CO3 concentration for 70 minutes led to 28% sericin removal while incubation with 2% citric acid concentration for 94 minutes at 98?C yielded the similar result. Degumming with alcalase using factorial design indicated that treatment with 2.5% alcalase for 60 minutes could remove sericin satisfactorily at 28%. Degumming by autoclaving at 121?C for 30 minutes showed that sericin could not be completely extracted with single treatment (18% sericin removal) while the solubilization of fibroin and whole yellow silk cocoons was nearly complete in Ajisawa's reagent (77 and 84%, respectively). Further, it was found that with repetitive heat treatment by autoclaving for four consecutive times, molecular weight of fibroin and whole silk cocoon including sericin degurnmed with Na2CO3 changed greatly while that of alcalase degummed sericin appeared intact. Suspension of sericin as well as fibroin was individually fractionated using ultrafiltration with 3, 10 and 30 kDa NMWCO membranes. Results showed that, for the first 20 minutes, all permeate fluxes declined more rapid than fluxes obtained at the later stages. The larger NMWCO membrane led to higher permeability representing lower fouling. Result on molecular weight distribution of each fraction indicated that ultrafiltration could effectively be employed to fractionate sericin and fibroin solution. Effect of supplementation of fractionated sericin/fibroin on Chinese Hamster Ovary (CHO) cell proliferation was accomplished using 3x4x5 factorial design. Results obtained revealed that concentration, types of sericin/fibroin and molecular weight as well as their interactions excluding an interaction between concentrations and molecular weight were considered statistically significant on promoting CHO cell proliferation. Sericin extracted with Na2CO3 showed the highest growth promoting efficacy at every concentration tested while fibroin and alcalase extracted sericin, commercial sericin and heat treatment extracted sericin were found to be inferior. Moreover, molecular weight of sericin/fibroin of more than 30 kDa showed higher efficiency on enhancing CHO proliferation than those of molecular size of 10-30, 3-10 and less than 3 kDa. Further, it was experimentally established that supplementation with 0.1% of sericin/fibroin led to significant higher cell density than those obtained with 0.03 and 0.3%. Additionally, supplementation with 0.1% of Na2CO3 degummed sericin with molecular weight of more than 30 kDa yielded better growth promoting efficacy on CHO cells than those obtained with other combinations of sericin/fibroin of various concentrations and molecular weight and, at the same time, comparable to that of bovine serum albumin. It was found be inferior to that of fetal bovine serum, however.

Abstract: เส้นไหมจากหนอนไหมพันธุ์ Bombyx mori ประกอบด้วยเส้นใยไฟโบรอินสองเส้นติดรวมอยู่ด้วยกัน โดยมีซิริซินทำหน้าที่คล้ายกาวเคลือบใยไฟโบรอินทั้งสองเส้นนั้นให้ติดกัน เมื่อไม่นานมานี้มี ไฟโบรอินและซิริซินเริ่มได้รับความสนใจเป็นอย่างสูง เนื่องจากมีประโยชน์ทางด้านเทคโนโลยีชีวภาพ รวมทั้งการเป็นส่วนผสมในวัสดุชีวภาพ ซิริซินและไฟโบรอินเป็นโปรตีนที่ได้จากธรรมชาติ สามารถสกัดได้ จากรังไหมซึ่งมีฤทธิ์ทางชีวภาพ โปรตีนทั้งสองชนิดนั้นมีช่วงของมวลโมเลกุลที่กว้าง ซึ่งแต่ละช่วง มวลโมเลกุลแสดงถึงลักษณะสมบัติทางเคมีที่แตกต่างกัน โดยคุณสมบัติ และประสิทธิภาพของโปรตีนทั้ง สองชนิดนั้นขึ้นกับสภาวะในการสกัดและสารละลายที่นำมาสกัด ในการศึกษานี้ได้ใช้สารสกัดด่าง (Na2CO3) เอนไซม์อัลคาเลส กรดซิตริก และการสกัดด้วยความร้อนภายใต้ความดัน (autoclave) ในการสกัดซิริซิน รวมถึงการใช้ Ajisawa's reagent ในการสกัดไฟโบรอิน และรังไหมเหลือง การออกแบบการทดลองด้วยวิธี Response Surface Methodology (RSM) ได้ถูกนำมาใช้ในการทำนายสภาวะที่เหมาะสมในการสกัดซิริซิน ด้วยสารสกัดด่างและกรดซิตริก ผลการศึกษาโดยวิธีการทดลองแบบ RSM แสดงให้เห็นว่าการสกัดซิริซิน โดยแช่รังไหมในสารสกัดด่างที่มีความเข้มข้น 0.9% เป็นเวลา 70 นาที สามารถสกัดซิริซินได้ 28% ในขณะที่การสกัดซิริซินด้วยกรดซิตริกพบว่า ความเข้มข้นของกรดซิตริก 2% ที่อุณหภูมิ 98 C เป็นเวลา 94 นาที ให้ผลการสกัดซิริซินได้ 28% เท่ากันกับการสกัดด้วยสารสกัดด่าง การสกัดซิริซินด้วย เอนไซม์อัลคาเลสโดยการออกแบบการทดลองแบบ factorial design พบว่า การสกัดซิริซินด้วยเอนไซม์อัลคาเลส ที่ความเข้มข้น 2.5% นาน 60 นาที สามารถสกัดซิริซินได้ 28% เช่นกัน การสกัดซิริซินด้วยความร้อนภายใต้ ความดันสูงที่อุณหภูมิ 121 C เป็นเวลา 30 นาที แสดงให้เห็นว่า การสกัดด้วยความร้อนภายใต้ความดัน เพียงครั้งเดียวไม่สามารถสกัดซิริซินจากรังไหมได้หมด (สามารถสกัดซิริซินได้ 18%) ในขณะที่ การละลายของไฟโบรอินและรังไหมสีเหลืองสามารถละลายใน Ajisawa's reagent ได้เกือบสมบูรณ์ (77 และ 84% ตามลำดับ) จากการศึกษาผลของการให้ความร้อนภายใต้ความดันด้วย autoclave กับซิริซินและไฟโบรอินซ้ำๆ ต่อเนื่องตามลำดับ พบว่าความร้อนจาก autoclave มีผลทำให้มวลโมเลกุลของสารละลายไฟโบรอินและ รังไหมรวมถึงซิริซินที่สกัดด้วยสารสกัดด่างมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมาก ในขณะที่ซิริซินที่ สกัดด้วยเอนไซม์อัลคาเลสพบการเปลี่ยนแปลงเนื่องจากความร้อนน้อยมาก สารละลายซิริซินและไฟโบรอิน ที่ได้จากการสกัดด้วยวิธีต่างๆได้ถูกนำมาแยกขนาดของมวลโมเลกุลด้วยวิธี ultrafiltration โดยใช้เมมเบรน 3 ขนาด ได้แก่ 3 10 และ 30 kDa ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าในช่วง 20 นาทีแรก permeate flux ของสารละลายซิริซินและไฟโบรอินลดลงอย่างรวดเร็ว หลังจากนั้น flux จะลดลงอย่างช้าๆ จนกระทั่งคงที่ในที่สุด โดยเมมเบรนที่มี NMWCO กว้างโมเลกุลของโปรตีนจะสามารถผ่านเมมเบรนได้ดี และความเร็วของการอุดตันจะเกิดขึ้นได้ช้ากว่าเมมเบรนที่มี NMWCO แคบ การกระจายตัวของมวลโมเลกุล ของแต่ละ fraction ชี้ให้เห็นว่า ultrafiltration สามารถแยกขนาดโมเลกุลของซิริซินและไฟโบรอิน ได้อย่างมีประสิทธิภาพ จากการศึกษาผลของซิริซินและไฟโบรอินต่อการเจริญของเซลล์ Chinese Hamster Ovary (CHO) โดยการออกแบบการทดลองแบบ 3*4*5 factorial design พบว่า ซิริซินและไฟโบรอินที่สกัดด้วย วิธีต่างกัน ความเข้มข้นของโปรตีน และขนาดมวลโมเลกุลของโปรตีน รวมทั้งปฏิสัมพันธ์ร่วมกัน ระหว่างซิริซินและไฟโบรอินที่สกัดด้วยวิธีต่างกัน กับความเข้มข้นของโปรตีนและซิริซินและ ไฟโบรอินที่สกัดด้วยวิธีต่างกันกับขนาดมวลโมเลกุลของโปรตีน ยกเว้นปฏิสัมพันธ์ร่วมกันระหว่าง ความเข้มข้นของโปรตีนและขนาดมวลโมเลกุลของโปรตีนมีผลต่อการเจริญของเซลล์ CHO อย่างมีนัยสำคัญ ทางสถิติ นอกจากนี้ผลการศึกษายังแสดงให้เห็นว่า การเติมซิริซินที่สกัดด้วยสารสกัดด่างช่วย ส่งเสริมการเจริญของเซลล์ CHO สูงสุดในทุกความเข้มข้น ในขณะที่การเติมไฟโบรอิน ซิริซินสำเร็จรูป และซิริซินที่สกัดด้วยความร้อนภายใต้ความดันจาก autoclave และเอนไซม์อัลคาเลสให้ผลรองลงมา นอกจากนี้ซิริซินและไฟโบรอินที่มีขนาดมวลโมเลกุลมากกว่า 30 kDa มีประสิทธิภาพในการกระตุ้น การเจริญของเซลล์ CHO สูงกว่าโปรตีนที่มีมวลโมเลกุลขนาด 10-30 10-3 และน้อยกว่า 3 kDa การเติมไฟโบรอินและซิริซินที่มีความเข้มข้น 0.1%ให้ผลการเจริญของเซลล์ CHO สูงที่สุด โดยที่การเติมความเข้มข้นที่ 0.03% และ 0.3% ให้ผลรองลงมา ดังนั้นสามารถสรุปได้ว่า การเติมซิริซินที่สกัดด้วยสารสกัดด่างที่มีขนาดมวลโมเลกุลมากกว่า 30 kDa ที่ความเข้มข้น 0.1 % ส่งผลต่อการเจริญของเซลล์ CHO ดีที่สุด เมื่อเทียบกับความเข้มข้น มวลโมเลกุลของ ไฟโบรอิน รวมทั้งซิริซินที่สกัดด้วยวิธีการสกัดชนิดอื่นนอกจากนี้ยังมีประสิทธิภาพใกล้ เคียงกับประสิทธิภาพของ bovine serum albumin แต่อย่างไรก็ตาม ยังคงให้ผลในการช่วยเจริญ ของเซลล์ CHO ด้อยกว่า เมื่อเทียบกับประสิทธิภาพของ fetal bovine serum

King Mongkut's University of Technology Thonburi. KMUTT Library.

Address: BANGKOK

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: Saengchai Akeprathumchai

Role: Advisor

Created: 2552-12-27

Modified: 2552-12-27

Issued: 2009-12-27

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: BIT593

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: King Mongkut's University of Technology Thonburi

©copyrights King Mongkut's University of Technology Thonburi

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	BIT593.pdf	2.65 MB	141	2024-11-27 16:16:45
2	BIT593ab.pdf	43.36 KB	62	2024-11-27 16:17:56

ใช้เวลา

0.028799 วินาที