Taxonomy and Protease of Halophilic bacteria isolated from Pla-ra

อนุกรมวิธานและโพรทิเอสของแบคทีเรียชอบเค็มจากปลาร้า

Name: Nitcha Chamroensaksri

LCSH: Halophilic microorganisms -- Classification

Abstract: In the isolation for protease-producing halophilic bacteria, fifty seven isolates from 46 samples of fermented fish, pla-ra collected from the markets and home made factories were isolated. These bacteria were divided into nine groups based on their phenotypic and chemotaxonomic characteristics including 16S rDNA sequences of the representative strains. Fifty-five strains were Gram-positive rods belonged to genus Virgibacillus 38 isolates, Halobacillus 6 isolates, Gracilibacillus 1 isolate and Bacillus 2 isolates. Two of Gram-negative rods were Salinivibrio and Chromohalobacter. They were identified as V. dokdonensis 10 isolates, V. halodenitrificans 13 isolates and V. marismortui 13 isolates and Virgibacillus sp. 1 isolate, Bacillus sp. 10 isolates, and C. salexigens 1 isolate. In addition, ND1-1 contained ubiquinone with 8 isoprene unit, cellular fatty acids of C16:0 and C12:0, phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG), and diphosphatidylglycerol (DPG). DNA G+C content was 49.0 mol%. The 16S rDNA sequence analyses indicated that strain ND1-1 was closely related to S. costicola and S. proteolytica 98.3-98.6%. Based on its low levels of DNA-DNA relatedness to the type strains of Salinivibrio, therefore it was proposed as S. siamensis sp. nov. TP2-8 contained MK-7, cellular fatty acids of anteiso-C15:0, iso-C15:0 and anteiso-C17:0, and the polar lipids of PG, DPG and unidentified glycolipid. DNA G+C content was 37.6 mol %. The 16S rDNA sequence analyses indicated that strain TP2-8 was different from Gracilibacillus (96.2-99.2%). Based on its low levels of DNA-DNA relatedness to the type strains of Gracilibacillus, therefore it was proposed as G. thailandensis sp. nov. Strain ND1-1 was selected for further study due to the high protease production. The moderately halophilic bacterium, strain ND1-1 produced extracellular protease at the middle of exponential phase. The maximum protease production of ND1-1 was at the beginning of stationary phase and could be achieved when cultivated in a JCM no.377 medium (pH 8.0) that replaced casamino acids with 0.5% skim milk and incubated at 37°C for 2 days. At the optimal condition, the crude protease produced by strain ND1-1 increased 6.25 times. The purified protease from ND1-1 was monomeric protein with the molecular mass of about 36.8 kDa. The enzyme had a maximal activity in the presence of 5% w/v NaCl, pH 8.0 at 55°C. Stability remained more than 50% in the presence of 5-30% w/v NaCl, pH 5.0-9.0 and at 30–55 °C. The ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was found to inhibit the protease activity strongly, suggesting that the ND1-1 protease was metalloprotease.

Abstract: ในการคัดแยกสายพันธุ์แบคทีเรียชอบเค็มที่สร้างโพรทิเอสจากปลาร้าที่เก็บจากตลาดและผลิตภัณฑ์ครัวเรือน จำนวน 46 ตัวอย่าง พบว่าสามารถแยกแบคทีเรียชอบเค็มได้จำนวน 57 ไอโซเลต จากผลการศึกษาลักษณะทางฟีโนทป์ และผลทางอนุกรมวิธานเคมีรวมทั้งการวิเคราะห์ลำดับเบสในช่วง 16S rDNAของสายพันธุ์ตัวแทน สามารถแบ่งแบคทีเรียที่แยกได้เป็น 9 กลุ่ม โดยเป็นแบคทีเรียแกรมบวก 55 สายพันธุ์ในสกุล Virgibacillus จำนวน 38 สาย พันธุ์ Halobacillus 6 สายพันธุ์ Gracilibacillus 1 สายพันธุ์ และ Bacillus 10 สายพันธุ์ และแบคทีเรียแกรมลบในสกุล Salinivibrio และ Chromohalobacter สกุลละ 1 สายพันธุ์ พิสูจน์เอกลักษณ์แบคทีเรียที่แยกได้เป็น V. dokdonensis 10 สายพันธุ์ V. halodenitrificans 13 สายพันธุ์ V. marismortui 13 สายพันธุ์ Virgibacillus sp. 1 สายพันธุ์ Halobacillus sp. 6 สายพันธุ์ Bacillus sp. 10 สายพันธุ์ และ Chromohalobacter salexigens 1 สายพันธุ์ นอกจากนี้พบว่าจากลักษณะ ทางอนุกรมวิธานเคมีของสายพันธุ์ ND1-1 ซึ่งมี ubiquinone-8 กรดไขมันเป็น C16:0 และ C12:0 polar lipids เป็น phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG) และ diphosphatidylglycerol (DPG) มีปริมาณ G+C ของ DNA เป็น 49.0 โมลเปอร์เซ็นต์ ผลการวิเคราะห์ลำดับเบสในช่วง 16S rDNA ใกล้เคียงกับ S. costicola และ S. proteolyticus (98.3-98.6 เปอร์เซ็นต์) และมีความคล้ายคลึงของ DNA ต่ำเมื่อเทียบกับสายพันธุ์มาตรฐานของ Salinivibrio จึงเสนอเป็นแบคทีเรียสปิชีส์ใหม่ชื่อว่า S. siamensis ส่วนสายพันธุ์ TP2-8 มี menaquinone-7, กรดไขมัน เป็น เป็น anteiso-C15:0, iso-C15:0 and anteiso-C17:0 และมี polar lipids เป็น PG, DPG และ unidentified glycolipid ปริมาณ G+C ของ DNA เป็น 37.6 โมลเปอร์เซ็นต์ ผลการวิเคราะห์ลำดับเบสในช่วง 16S rDNA ใกล้เคียงกับ Gracilibacillus (94.9-99.2 เปอร์เซ็นต์) และมีความคล้ายคลึงของ DNAการศึกษาโพรทิเอสจากสายพันธุ์ ND1-1 ที่คัดเลือกได้ พบว่า ND1-1 สามารถสร้างโพรทิเอสได้ทั้งใน สภาวะที่มีความเข้มข้นของเกลือ NaCl 5 และ 10 เปอร์เซ็นต์ พบว่า ND1-1 เริ่มผลิตโพรทิเอสในระยะกลางของการ เจริญเติบโต และสร้างสูงสุดในระยะ stationary phase เมื่อเลี้ยงในอาหาร JCM no. 377 ในเวลา 2 วัน นอกจากนี้พบว่า สามารถสร้างโพรทิเอสได้สูงสุดในอาหาร JCM no. 377 ที่ดัดแปรโดยแทนที่ casamino acids ด้วย skim milk 0.5 เปอร์เซ็นต์ ที่ pH 8.0 และที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ลักษณะสมบัติของโพรทิเอสบริสุทธิ์ที่แยกได้มีน้ำหนักโมเลกุล 36.8 kDa และทำปฏิกิริยาได้ดีที่สุดในสภาวะที่มีความเข้มข้นเกลือ NaCl 5 เปอร์เซ็นต์ และ pH 8.0 ที่ อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส และมีความเสถียรมากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์ เมื่ออยู่ในสภาวะที่มีความเข้มข้นเกลือ NaCl 5- 30 เปอร์เซ็นต์ ที่ pH 5.0-9.0 และที่อุณหภูมิ 30–55 องศาเซลเซียส กิจกรรมของโพรทิเอสถูกยับยั้งโดย EDTA แสดง ให้ทราบว่าโพรทิเอสจาก ND1-1 เป็น metalloprotease ต่ำเมื่อเทียบกับสายพันธุ์มาตรฐานของ Gracilibacillus จึงเสนอเป็นแบคทีเรียสปิชีส์ใหม่ชื่อว่า G. thailandensis การศึกษาโพรทิเอสจากสายพันธุ์ ND1-1 ที่คัดเลือกได้ พบว่า ND1-1 สามารถสร้างโพรทิเอสได้ทั้งในสภาวะที่มีความเข้มข้นของเกลือ NaCl 5 และ 10 เปอร์เซ็นต์ พบวา ND1-1 เริ่มผลิตโพรทิเอสในระยะกลางของการเจริญเติบโตและสร้างสูงสุดในระยะ stationary phase เมื่อเลี้ยงในอาหาร JCM no. 377 ในเวลา 2 วัน นอกจากนี้ พบว่าสามารถสร้างโพรทิเอสได้สูงสุดในอาหาร JCM no. 377 ที่ดัดแปรโดยแทนที่ casamino acids ด้วย skim milk 0.5 เปอร์เซ็นต์ ที่ pH 8.0 และที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ลักษณะสมบัติของโพรทิเอสบริสุทธิ์ที่แยกได้มีน้ำหนักโมเลกุล 36.8 kDa และทำปฏิกิริยาได้ดีที่สุดในสภาวะที่มีความเข้มข้นเกลือ NaCl 5 เปอร์เซ็นต์ และ pH 8.0 ที่ อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียส และมีความเสถียรมากกว่า 50 เปอร์เซ็นต์ เมื่ออยูในสภาวะที่มีความเข้มข้นเกลือ NaCl 5- 30 เปอร์เซ็นต์ ที่ pH 5.0-9.0 และที่อุณหภูมิ 30–55 องศาเซลเซียส กิจกรรมของโพรทิเอสถูกยับยังโดย EDTA แสดง ให้ทราบว่าโพรทิเอสจาก ND1-1 เป็น metalloprotease

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Somboon Tanasupawat

Role: advisor

Name: Wonnop Visessanguan

Role: advisor

Name: Takashi Itoh

Role: advisor

Created: 2008

Modified: 2020-06-19

Issued: 2020-06-19

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/52899

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Pharmaceutical Chemistry and Natural Products

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	nitcha_ch_front[1].pdf	1.92 MB
2	nitcha_ch_ch1[1].pdf	522.83 KB
3	nitcha_ch_ch2[1].pdf	5.91 MB
4	nitcha_ch_ch3[1].pdf	2.18 MB
5	nitcha_ch_ch4[1].pdf	7.83 MB
6	nitcha_ch_ch5[1].pdf	528.52 KB
7	nitcha_ch_back[1].pdf	5.62 MB

ใช้เวลา

-0.969935 วินาที