Development of a Competitive ELISA for Cortisol Determination

การพัฒนา Competitive ELISA สำหรับตรวจวัดปริมาณคอร์ติซอล

Name: Komsit Wisitrassameewong

Organization : King Mongkut's University of Technology Thonburi. School of Bioresources and Technology. Biotechnology

Name: คมสิทธิ์ วิศิษฐ์รัศมีวงศ์

Organization : มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี. สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวภาพ

keyword: Competitive ELISA

; Cortisol Determination

; คอร์ติซอล

Abstract: Development and validation of competitive ELISA for cortisol determination are described in the thesis. Anti-cortisol monoclonal antibody (Anti-cortisol Mab) used for the assay was produced from hybridoma cells and concentrated using ultrafiltration (UF). The concentrated monoclonal antibody was then used to optimize a competitive ELISA for cortisol determination. Optimal concentrations of the 3 components of the assays, antimouse immunoglobulin G (anti-mouse IgG), anti-cortisol MAb and cortisol-HRP, were 100 ng/well, 100 ng/well and 1:2,000 dilutions of 0.7 mg/ml, respectively. The cortisol calibration curve ranged from 156 to 10,000 pg/ml with R2 coefficient of 0.9912. The performance characteristics of this immunoassay, i.e., sensitivity, linearity and precision, were investigated. Sensitivity of the developed assay was 77.28 pg/ml. The linearity was determined by graphically plot of actual cortisol concentration versus measured cortisol concentration. The line obtained had a slope of 1.0645 and a correlation coefficient of 0.9784. The intra- and inter-assay coefficient of variations (CVs) ranged from 6% to 9.7% and from 7.4% to 7.5%, respectively. The main application of this assay is for stress detection which the cortisol level has a tendency towards very high concentration. The calibration curve was therefore extended to 40,000 pg/mL. The R2 of this new extended curve was 0.9903 which was acceptable by standard requirement. The developed assay was used to measure level of salivary cortisol in 6 pigs from SPM farm, Ratchaburi Province. The measured saliva cortisol concentrations were categorized into criteria of stress level in pig based on the cortisol levels. None of pig tested were in stress stage which is ill agreement with their environmental and physiological conditions.

Abstract: ในวิทยานิพนธ์นี้ได้ทำการพัฒนาและการตรวจสอบคุณภาพของชุดตรวจวัดฮอร์โมนคอร์ติชอลในรูป แบบ Competitive ELISA โดยใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดี้ที่จำเพาะต่อฮอร์โมนคอร์ติซอลซึ่งผลิตโดย hybridoma cells และทำให้เข้มข้นขึ้นด้วยวิธีการ ultrafiltration จากการศึกษาพบว่า 3 องค์ประกอบ หลักของชุดตรวจ ได้แก่ anti-mouse immunoglobulin G (anti-mouse IgG) ปริมาณ 100 ng / หลุม โมโนโคลนอลแอนติบอดี้ที่จำเพาะต่อฮอร์โมนคอร์ติซอล ปริมาณ 100 ng / หลุมและ cortisol-HRP ความเข้มข้นที่เจือจาง 1:2,000 (ความเข้มข้นเริ่มต้น 0.7 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร) ในปริมาตร 50 ng / หลุม กราฟมาตรฐานของคอร์ติซอลของชุดตรวจสำหรับคอร์ติซอลในช่วงระหว่าง 156 ถึง 10,000 พิโคกรัมต่อ มิลลิเมตร มีค่า R2 coefficient เท่ากับ 0.9912 และเมื่อตรวจสอบประสิทธิภาพของชุดตรวจทดสอบจาก ปริมาณคอร์ติซอลน้อยที่สุดที่ตรวจวัดได้ (sensitivity) คือ 77.28 พิโคกรัม/มิลลิลิตร กราฟของการทดสอบ ความเป็นเส้นตรงของกราฟมาตรฐานระหว่างปริมาณคอร์ติซอลที่แท้จริงกับปริมาณคอร์ติซอลที่ใช้ชุด ตรวจสอบนี้วัด มีค่าความชันเท่ากับ 1.0645 และความเป็นเส้นตรงเท่ากับ 0.9784 ค่าเปอร์เซ็นต์ความ แปรปรวน (CV) ของ intra-assay อยู่ในช่วงระหว่าง 6% ถึง 9.7% และ inter-assay อยู่ในช่วงระหว่าง 7.4% ถึง 7.5% เนื่องจากวัตถุประสงค์หลักในการพัมนาชุดตรวจนี้เพื่อใช้ในการตรวจวัดความเครียดซึ่งมีแนวโน้ม ว่าจะมีปริมาณคอร์ติซอลในสิ่งตรวจค่อนข้างสูง จึงได้มีการขยายช่วงความเข้มข้นของคอร์ติซอลในกราฟ มาตรฐานจนถึง 40,000 พิโคกรัมต่อมิลลิลิตร ซึ่งพบว่ากราฟมาตรฐานใหม่นี้ยังมีค่า R2 ที่ 0.9903 ซึ่งอยู่ในช่วง มาตรฐานที่ยอมรับได้ ชุดตรวจวัดที่พัฒนานี้ได้ถูกนำไปใช้ในการตรวจวัดปริมาณฮอร์โมนคอร์ติซอลในน้ำลาย ของสุกร โดยทำการเก็บตัวอย่างน้ำลายจากสุกร 6 ตัวจากฟาร์มเอสพีเอ็มที่จังหวัดราชบุรี ฮอร์โมนคอร์ติซอลที่ตรวจ วัดได้เมื่อนำมาเปรียบเทียบกับเกณฑ์บ่งชี้ระดับความเครียดในสุกร โดยใช้ความเข้มข้นของคอร์ตอซอลในการจำแนกนั้น พบว่าสุกรที่ทำการศึกษาไม่ได้อยู่ในสภาวะเครียดซึ่งสอดคล้องกับสภาวะแวดล้อมและสภาพร่างกายของสุกร

King Mongkut's University of Technology Thonburi. KMUTT Library.

Address: BANGKOK

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: Kanokwan Poomputsa

Role: Advisor

Name: Phenjun Mekvichitsaeng

Role: Advisor

Name: กนกวรรณ พุ่มพุทรา

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Name: เพ็ญจันทร์ เมฆวิจิตรแสง

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Created: 2007

Modified: 2552-09-04

Issued: 2009-09-04

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: BIT576

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: King Mongkut's University of Technology Thonburi

©copyrights King Mongkut's University of Technology Thonburi

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	BIT576.pdf	1.42 MB	123	2023-12-24 21:04:07
2	BIT576ab.pdf	93.09 KB	51	2018-07-23 19:51:01
3	BIT576aben.txt	2.12 KB	43	2018-05-13 21:54:46
4	BIT576abth.txt	2.1 KB	29	2022-07-05 13:20:33

ใช้เวลา

0.044874 วินาที