Cloning and expression of Pseudomonas aeruginosa major outer membrane porin protein F (OprF) and specific polyclonal antibody production

การโคลนนิ่งและการสร้าง major outer membrane porin protein F (OprF) ของเชื้อ Pseudomonas aeruginosa และการผลิต Polyclonal antibody ที่จำเพาะ

Name: Benjaporn Bhusri.

LCSH: Antibiotics.

LCSH: Pseudomonas aeruginosa.

LCSH: Time-of-flight mass spectrometry.

MeSH: OprD protein, Pseudomonas aeruginosa.

Abstract: Carbapenems are effective antibiotics for the treatment of infections caused by multidrug-resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa. However, resistance to these antibiotics, such as imipenem, has increased steadily in recent years. The major mechanism of imipenem resistance in P. aeruginosa is a loss of OprD protein on the outer membrane that usually forms specific channels for uptake of basic amino acids and imipenem into the cells. From OprD-mediated resistance, an OprD detection technique was developed for imipenem susceptibility testing. Species confirmation of the pathogen should be considered as an internal control of the immunological test, since this resistance mechanism may be shared also by other pseudomonads. In this study, a major outer membrane porin protein F (OprF) is interesting in view of its species specificity for P. aeruginosa. The whole oprF gene of P. aeruginosa PA10 clinical strain was cloned into pET-28b plasmid and expressed for a (His)6-tagged OprF fusion protein in E. coli BL21. The fusion protein in form of an insoluble inclusion body was purified by HisTrap HP column chromatography, confirmed its identity by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, and prepared for specific polyclonal antibody production in a New Zealand White rabbit. The anti-OprF polyclonal antibody was used to determine the specificity in Western blot analysis, and it showed a specific band of OprF protein from wild type P. aeruginosa and 6 clinical isolates. It showed no cross-reaction in other Pseudomonas species, such as P. alcaligenes, P. fluorescens, P. mendocina, P. putida, P. stutzeri, and P. syringae. There was no specific banding pattern in E. coli ATCC 25922 and BL21. These results suggested that OprF protein may be used in characterization of P. aeruginosa at the species level.

Abstract: ยากลุ่ม carbapenem นับเป็นยาต้านจุลชีพที่มีประสิทธิภาพสำหรับการรักษาการติดเชื้อ Pseudomonas aeruginosa ที่ดื้อยาหลายขนาน แต่ในปัจจุบันพบว่า เชื้อดื้อต่อยาในกลุ่มนี้เช่น ยา imipenem เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง โดยกลไกหลักที่เชื้อใช้ในการดื้อยา imipenem คือ การสูญหายของโปรตีน OprD บนเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอก ซึ่งปกติมีหน้าที่ในการนำกรดอะมิโนที่เป็นเบสเข้าสู่เซล์และยังเป็นช่องทางสำหรับนำเข้ายา imipenem จากความรู้เรื่องการดื้อยาจากการเปลี่ยนแปลงของโปรตีน OprD ได้มีการนำเทคนิคการตรวจหาโปรตีน OprD มาใช้กับชุดตรวจหาความไวต่อยา imipenem ของเชื้อ P. aeruginosa ซึ่งใน อนาคตจะมีการพฒันาต่อไป แต่การพิสูจน์ยืนยันเชื้อ P. aeruginosa นับเป็นเรื่องสำคัญในแง่ของการเป็น internal control ของชุดทดสอบ เนื่องจากกลไกการดื้อยานี้อาจพบได้ในเชื้อ pseudomonads อื่น ๆ ในการทดลองนี้จึงไดศึ้กษาโปรตีน OprF ซึ่งเป็นโปรตีนส่วนใหญ่บนเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอกของเชื้อ P. aeruginosa ในแง่ของความจำเพาะ เพื่อบอกว่าเชื้อที่ทดสอบเป็นเชื้อ P. aeruginosa หรือไม่ การทดลองเริ่มจากการนำยีน oprF ของเชื้อ P. aeruginosa PA10 เข้า pET-28b expression vector และทำ ให้เกิดการสร้าง (His)6-tagged OprF ใน E. coli BL21 โปรตีนนี้อยู่ในรูป inclusion body และถูกนำมาทำให้บริสุทธิ์โดยคอลมั น์โครมาโตกราฟฟี HisTrap HP หลงั จากนำทฤษฎีการวิเคราะห์โปรตีนเพื่อยืนยนั โดย MALDI-TOF mass spectrometry ก่อนจะนำไปเตรียมเพื่อทำการผลิต polyclonal antibody จากกระต่าย ซึ่งแอนติบอดี้ที่ได้จะมีความจำเพาะต่อโปรตีน OprF ในการวิเคราะห์หาความจำเพาะของโปรตีน OprF ต่อเชื้อ P. aeruginosa ใช้วิธีวิเคราะห์โดย Western blot ซึ่งผลการทดลองพบว่า โปรตีน OprF มีความจำเพาะต่อเชื้อ P. aeruginosa ไม่พบ cross-reaction กับเชื้อ Pseudomonas สปีชีส์อื่น ได้แก่ P. alcaligenes, P. fluorescens, P. mendocina, P. putida, P. stutzeri, P. syringae และไม่พบว่ามีความจำเพาะต่อโปรตีนจาก E. coli BL21 และ E. coli ATCC 25922.

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanwit Tribuddharat

Role: Thesis Advisors

Name: Somporn Srifuengfung

Role: Thesis Advisors

Name: Iyarit Thaipisuttikul

Role: Thesis Advisors

Name: Chrtsak Dhiraputra

Role: Thesis Advisors

Created: 2013

Modified: 2019-11-15

Issued: 2019-11-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH B468c 2013

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Microbiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5336394.pdf	15.02 MB	1	2020-02-13 11:32:34

ใช้เวลา

0.288164 วินาที