Characterization of Xylanolytic-cellulolytic Enzyme Complexes from Paenibacillus curdlanolyticus strain B-6

การศึกษาคุณลักษณะของ เอนไซม์เชิงซ้อนในกลุ่ม xylanolytic cellulolytic จากเชื้อ Paenibacillus curdlanolyticus สายพันธุ์ B-6

Name: Patthra Pason

Organization : King Mongkut's University of Technology Thonburi. School of Bioresources and Technology. Biochemical Technology

Name: ภัทรา ผาสอน

Organization : มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี. สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวเคมี

keyword: Affinity Purification

; Multienzyme Complex

; Paenibacillus curdlanolyticus Strain B-6

; Xylan-binding Endoxylanase

; Xylanolytic-cellulolytic System

; การทำให้ไซลาเนสบริสุทธิ์แบบจำเพาะ

; เอนไซม์เชิงซ้อน

Abstract: The objective of this study is to gain basic knowledge of properties and functions of multienzyme complex for improvement of biodegradation of insoluble polysaccharides, especially multienzyme complex produced in an aerobic condition. The Bacillus sp. strain B-6 is the best producer of xylanase and cellulase enzymes with the best binding ability of xylanase to insoluble xylan and avicel. Among six high cellulase and xylanase producing strains tested, only the strain B-6 cell could adhere to both avicel and insoluble xylan whereas the other strains could not adhere to both of them. The result indicated that Bacillus sp. strain B-6 may produce the multienzyme complex. The 16S rDNA of this strain is 1,424 base pair in length and 97% similarity with Paenibacillus curdlanolyticus. Therefore, it was identified as Paenibacillus curdlanolyticus strain B-6 (formerly Bacillus circulans B-6). The bacterium is an facultatively anaerobic bacterium, isolated from an anaerobic digester and produces extracellular multienzyme containing xylanase, ?-xylosidase, arabinofuranosidase, acetyl esterase, mannanase, carboxymethyl cellulase (CMCase), avicelase, cellobiohydrolase, ?-glucosidase, amylase and chitinase when grown on xylan under aerobic conditions. Scanning electron microscopy (SEM) analysis revealed the adhesion of cell to xylan during the early exponential growth phase till the late stationary growth phase. Multienzyme complexes which adhere to cell surface at the early exponential growth phase were purified by elution with 1% TEA, while multienzyme complexes at the late stationary growth phase were purified by affinity purification on cellulose. Native-polyacrylamide gel electrophoresis (native-PAGE) and sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) indicated that two native forms by native-PAGE of isolated multienzyme complex from cell pellet composed of at least 24 protein subunits ranging in molecular masses from 23 to 224 kDa by SDS-PAGE. Zymograms showed 3 xylanases and 1 CMCase. The Sephacryl S-300 gel filtration showed that the isolated multienzyme complex consisted of two protein peaks (peaks I and II) as the two multienzyme complexes with molecular masses of 1,450 and 400 kDa. The multienzyme complex I (1,450 kDa) consisted of 8 protein subunits. The activity of xylanase in multienzyme complex I was found to reach the maximum at pH 6.0 and at 40 C and the stability was larger than 50% when the pH was lower than pH 7.0 and the temperature was lower than 50?C. The multienzyme complex I was responsible to degrade the insoluble substances efficiently especially oat spelt xylan with short chain and many branches due to the presence of carbohydrate-binding modules (CBMs). Cellulose-binding protein isolated from culture supernatant by affinity purification with avicel exhibited 9 protein subunits on SDS-PAGE and 8 xylanases and 6 CMCases on zymograms. After isolated by gel filtration on Sephacryl S-300, the cellulose-binding protein exhibited 4 protein peaks (peaks I, II, III and VI) consisted of two multienzyme complexes with the molecular masses of 1,450 and 400 kDa. Peaks III and IV may contain single enzymes with substrate-binding modules and possibly could be the fragments from the high molecular mass multienzyme complex I. Xylan-binding xylanase was purified to homogeneity by specific adsorption and desorption on insoluble xylan. The molecular masses of the purified xylanase were estimated to be 29 and 48 kDa, which showed only xylanase activity. The purified enzymes hydrolyzed xylan to a series of short-chain xylooligosaccharides as the products, indicating that the enzymes were an endoxylanases. The xylan-binding endoxylanases could effectively hydrolyze low substituted insoluble xylan of birchwood more than larchwood and oat spelt. The multienzyme complex was found to be capable of binding to insoluble xylan and avicel and efficiently hydrolyzed insoluble xylan, avicel and corn hull to soluble sugars that were exclusively xylose and glucose. The results indicated that the xylanolytic-cellulolytic enzyme system of this bacterium exists as multienzyme complex. This is the first report of multienzyme complex production in an aerobic condition by Paenibacillus curdlanolyticus strain B-6

Abstract: วัตถุประสงค์ของงานวิจัยนี้เพื่อศึกษาคุณสมบัติและหน้าที่ของเอนไซม์เชิงซ้อนเพื่อพัฒนาการย่อยสลายพอลิแซคคาไรด์ที่ไม่ละลายน้ำด้วยวิธีทางทางชีวภาพ โดยเฉพาะเอนไซม์เชิงซ้อนที่ผลิตในสภาวะมีอากาศ Bacillus sp. สายพันธุ์ B-6 ผลิตเอนไซม์ไซลาเนสและเซลลูเลสได้สูงที่สุด ซึ่งไซลาเนสที่ผลิตได้ สามารถยึดเกาะกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำและอะไวเซลได้ดีที่สุด ทั้งนี้ระหว่าวเชื้อ 6 สายพันธุ์ที่ผลิตไซลาเนสและเซลลูเลสได้สูง เซลล์ของสายพันธุ์ B-6 เท่านั้นที่สามารถยึดจับกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำและอะไวเซลได้ ในขณะที่สายพันธุ์อื่นไม่สามารถยึดจับได้ ผลการทดลองนี้ชี้ให้เห็นว่า Bacillussp สายพันธุ์ B-6 ผลิตเอนไซม์เชิงซ้อนได้ เมื่อทำการวิเคราะห์ 16S rDNA ของเชื้อสายพันธุ์นี้พบว่ามีลำดับกรดนิวคลีอิกทั้งหมด 1,424 คู่เบส ซึ่งมีความคล้ายคลึงกับ Paenibacillus curdlanolyticusร้อยละ 97 ดังนั้นจึงจัดเชื้อชนิดนี้เป็น Paenibacillus curdlanolyticus สายพันธุ์ B-6 (จากเดิมBacillus circulans B-6) จุลินทรีย์ดังกล่าวสามารถเจริญได้ทั้งสภาวะที่มีอากาศและไม่มีอากาศ คัดแยกได้จากถังหมักก๊าชชีวภาพ สามารถผลิตเอนไซม์ได้หลายชนิด ได้แก่ ไซลาเนส เบต้า-ไซโลซิเดสอะราบิโนฟูราโนซิเดส อะซิติลเอสเทอเรส แมนนาเนส คาร์บอกซิเมลทิลเซลลูเลส อะไวเซลเลส เซลโลไบโอไฮโดรเลส เบต้า-กลูโคซิเดส อะไมเลส และไคตินเนส เมื่อเพาะเลี้ยงในอาหารที่มีไซแลนเป็นแหล่งคาร์บอนภายใต้สภาวะที่มีอากาศ เมื่อวิเคราะห์ด้วย scanning electron microscopic [SEM]พบว่าเซลล์สามารถยึดเกาะกับไซแลนในระยะ early exponential phase จนถึง late stationaryphase โดยองค์ประกอบและโครงสร้างของเอนไซม์เชิงซ้อนนั้นแตกต่างกันขึ้นกันระยะการเจริญเอนไซม์เชิงซ้อนที่ยึดเกาะบนผนังเซลล์ในระยะ early exponential phase แยกได้โดยการชะตะกอนเซลล์ด้วย TEA ร้อยละ 1 ในขณะที่เอนไซม์เชิงซ้อนในระยะ late stationary phase ซึ่งปลดปล่อยออกสู่อาหารเลี้ยงเชื้อ ทำให้บริสุทธิ์โดย affinity purification กับอะไวเซล เพื่อกำจัดโปรตีนปนเปื้อน เมื่อตรวจสอบด้วยเทคนิค native-polyacrylamide gel electrophoresis [native-PAGE]และsodiou dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) พบว่า เอนไซม์เชิงซ้อนที่ชะจากตะกอกเซลล์มีโปรตีน 2 กลุ่มใน รูปแบบธรรมชาติ ซึ่งประกอบด้วยโปรตีนหน่วยย่อยอย่างน้อย 24 ชนิด ที่มีขนาด 23-224 กิโลดาลตันใน SDS-PAGE ขณะที่zymograms พบว่ามีไซลาเนส 3 ชนิด และคาร์บอกซิเมลทิลเซลลูเลส 1 ชนิด เมื่อศึกษาด้วยSephacryl S-300 gel filtration พบว่าเอนไซม์เชิงซ้อนที่แยกได้ประกอบด้วยโปรตีน 2 กลุ่ม(peak I และ peak II) ซึ่งมี 2 เอนไซม์เชิงซ้อน ที่มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 1,450 และ 400 กิโลดาลตันเมื่อศึกษาเอนไซม์เชิงซ้อนกลุ่มที่ I (1,450 kDa) พบว่าประกอบด้วยโปรตีนหน่วยย่อย 8 หน่วย และมีกิจกรรมของไซลาเนสสูงสุดที่ pH 6.0 และ 40°C โดยมีเสถียรภาพของไซลาเนสมากกว่า 50% เมื่อ pH น้อยกว่า 7.0 และมีอุณหภูมิต่ำกว่า 50°C เอนไซม์เชิงซ้อนกลุ่มที่ I ย่อยสลายสับสเตรทที่ไม่ละลายน้ำได้ โดยเฉพาะไซแลนสายสั้นที่มีกิ่งก้านมาก (oat spelt xylan) เนื่องจากมีcarbohydrated-binding modules (CBMs) เป็นส่วนประกอบ Cellulose-binding proteins ซึ่งแยกจาก culture supernatant โดยวิธี affinity purificationกับอะไวเซล ประกอบด้วยโปรตีนหน่วยย่อย 9 ชนิด เมื่อตรวจสอบด้วย SDS-PAGE และไซลาเนส8 ชนิดและ CMCase 6 ชนิด เมื่อตรวจสอบด้วย zymograms การศึกษาด้วย Sephacryl S-300gelfiltration พบว่า cellulose-binding proteinsประกอบด้วยโปรตีน 4 กลุ่ม (peaks I II IIIและ IV) ซึ่งประกอบด้วย 2 เอนไซม์เชิงซ้อน ที่มีขนาด 1,450 และ 400 กิโลดาลตัน โดยที่ peak III และ IV อาจจะเป็นเพียงส่วนหนึ่งของเอนไซม์เชิงซ้อนกลุ่มที่ I ซึ่งมีขนาดใหญ่ไซลาเนส ที่ยึดเกาะกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำสามารถทำให้บริสุทธิ์โดยอาศัยเทคนิคการยึดเกาะ และหลุดออกอย่างจำเพาะกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำ ไซลาเนสที่ทำให้บริสุทธิ์มีขนาด 29 และ 48 กิโลดาลตัน ซึ่งแสดงออกเพียงกิจกรรมของไซลาเนส เอนไซม์บริสุทธิ์ย่อยสลายไซแลนได้ไซโลโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีขนาดเล็กต่างๆ เป็นผลิตภัณฑ์ แสดงว่าเอนไซม์จัดอยู่ในกลุ่มเอนโดไซลาเนส xylan-binding endoxylanase สามารถย่อยสลายไซแลนที่ไม่ละลายน้ำซึ่งมีโซ่กิ่งต่ำ โดยย่อยไซแลนจาก birch wood ได้ดีกว่าไซแลนจาก larch wood และ oat speltเอนไซม์เชิงซ้อนสามารถยึดเกาะกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำ และอะไวเซลได้ รวมทั้งมีประสิทธิภาพในการย่อยสลายไซแลนที่ไม่ละลายน้ำ อะไวเซล และเปลือกข้าวโพดให้เป็น้ำตาลที่ละลายน้ำได้(soluble sugars) ได้แก่ไซโลสและกลูโคส จากผลการทดลองชี้ให้เห็นว่ากลุ่มเอนไซม์ไซลาโนโลติกและเซลลูโลไลติกที่ผลิตจากเชื้อชนิดนี้จัดเป็นเอนไซม์เชิงซ้อน รายงานนี้เป็นครั้งแรกที่กล่าวถึงการผลิตเอนไซม์เชิงซ้อนภายใต้สภาวะที่มีอากาศ จากเชื้อ Paenibacillus curdlanolyticus สายพันธุ์B-6

King Mongkut's University of Technology Thonburi

Address: BANGKOK

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: Khanok Ratanakhanokchai

Role: Advisor

Name: Khin Lay Kyu

Role: Advisor

Name: กนก รัตนะกนกชัย

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Name: คิน เลย์ คู

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Created: 2005

Modified: 2009-02-03

Issued: 2551-07-03

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

text/plain

ISBN: 9741850441

CallNumber: BCT147

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemical Technology

Grantor: King Mongkut's University of Technology Thonburi

©copyrights King Mongkut's University of Technology Thonburi

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	BCT147.pdf	4.58 MB	107	2024-07-17 11:41:20
2	BCT147ab.pdf	98.37 KB	36	2018-05-10 19:27:43
3	BCT147aben.txt	5.09 KB	39	2018-05-10 19:27:43
4	BCT147abth.txt	11.26 KB	26	2020-06-12 15:53:46

ใช้เวลา

0.054481 วินาที