Study on Multiple Xylanases from Alkaliphilic Bacillus sp.

การศึกษา multiple xylanases จากบาซิลลัสทนด่าง

Name: Chakrit Tachaapaikoon

Organization : King Mongkut's University of Technology Thonburi. School of Bioresources and Technology. Biochemical Technology

Name: จักรกฤษณ์ เตชะอภัยคุณ

Organization : มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. คณะทรัพยากรชีวภาพและเทคโนโลยี. สาขาวิชาเทคโนโลยีชีวเคมี

keyword: Alkaliphilic Bacillus sp.

; multiple xylanases

; บาซิลลัสทนด่าง

Abstract: Alkaliphilic thermotolerant Bacillus sp. strain C-1 was identified as 99% similarity to Bacillus halodurans C-125 by 16S rDNA nucleotide sequence analysis. It produced cellulase-free xylanases when grown in an alkaline xylan medium. The optimum pH of the crude enzyme was 6.0 and it was stable in a wide range of pH 5.0 to 9.0. The optimum temperature of the crude enzyme was 70oC and it was stable up to 60oC. Zymogram analysis showed that the crude enzyme consisted of six xylanases with the molecular weight of 47.0, 43.0, 39.0, 34.3, 23.0 and 22.4 kDa. Among them, 23.0 and 22.4 kDa xylanases had binding ability to insoluble xylan. The crude enzyme was able to hydrolyze xylan in agricultural wastes such as corn husk, sugarcane bagasse, rice straw, corn cob and rice bran as well as xylan in kraft pulps such as sugarcane pulp, eucalyptus pulp and pine pulp. Xylanase I and xylanase II with molecular weights of 23.0 and 47.0 kDa, respectively, were purified to homogeneity from the crude enzyme by DEAE-Toyopearl, DEAE-Hiprep FF16/10 and Mono-Q HR 5/5 chromatography. The purified xylanase I exhibited an optimum pH at 7.0, whereas the purified xylanase II had an optimum pH in a wide range of pH 5.0 to 9.0. The pH stability of both purified xylanases was observed in a broad pH range. The purified xylanase I showed the highest activity at 60oC while the purified xylanase II had an optimum temperature at 70oC and it was more stable than the purified xylanase I. The Km and Vmax of the purified xylanase I were 4.33 mgml-1 and 63.5 ?molmin-1mg-1, respectively, whereas the purified xylanase II had a Km value of 0.30 mgml-1 and a Vmax of 210 ?molmin-1mg-1. Both purified xylanases were endoxylanases with different modes of action. The hydrolysis products of soluble oat spelt xylan by both xylanases were also different. The synergy between two purified xylanases was specified by a 116% increase in reducing sugars released by a combination of two xylanases as compared with the sum of reducing sugars by the individual xylanases.The purification of extracellular xylanase from an alkaliphilic Bacillus sp. K-8 by a simple method using its own insoluble substrate was studied. The pH, temperature and hydrolytic products, reducing sugar were found to affect the adsorption of xylanase to corn husk. Mild denaturants such as urea and sodium dodecyl sulphate, reducing sugar and triethylamine also affected the desorption of xylanase from xylanase-corn husk complex. The formation of hydrolytic product, sugars was prevented by controlling the condition at low pH and low temperature during purification steps. Under this control condition, xylanase from Bacillus sp. K-8 was purified to homogeneity in a single step by affinity adsorption-desorption on corn husk column.N-terminal amino acid sequence of xylan-binding xylanase produced from B. firmus K-1 was analyzed. The sequence was Lys-Phe-Val-Thr-Lys-Val-Leu-Thr-Val-Val-Ile-Ala. The xbx gene encoding a xylan-binding xylanase was cloned and expressed in Escherichia coli. The DNA sequence of the clone revealed that an open reading frame was 633 bp encoding a polypeptide of 210 codons. The molecular weight of recombinant xylanase was approximately 19.8 kDa. The recombinant xylanase hydrolyzed ?-1,4-glycosidic linkage of xylan and had strong xylan-binding ability. Moreover, the study of three dimensional structure by homology modeling of this xylan-binding xylanase gives similar three dimensional structure of xylanase of Bacillus circulans (1BVV.pdb).

Abstract: Bacillus sp. สายพันธุ์ C-1 ซึ่งทนด่างและอุณหภูมิสูง มีความคล้ายคลึงของลำดับกรดนิวคลีโอไทด์บริเวณ 16S rDNA ร้อยละ 99 เมื่อเปรียบเทียบกับ Bacillus halodurans C-125 จุลินทรีย์ดังกล่าวผลิตไซลาเนสที่ปราศจากเซลลูเลส เมื่อเจริญในอาหารที่มีไซแลนเป็นแหล่งคาร์บอนในสภาวะเป็นด่าง crude enzyme ทำงานได้ดีที่พีเอส 6.0 และมีเสถียรภาพดีในช่วงพีเอส 5.0 ถึง 9.0 crude enzyme ทำงานได้ดีที่สุดที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส และมีเสถียรภาพดีที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส จากการตรวจสอบโดยวิธี zymogram พบว่า crude enzyme ประกอบด้วยไซลาเนส 6 ชนิด ที่มีขนาด 47.0 43.0 39.0 34.3 23.0 22.4 กิโลดาลตัน โดยไซลาเนสขนาด 23.0 และ 22.4 กิโลดาลตัน สามารถยึดเกาะกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำได้ดี crude enzyme สามารถย่อยไซแลนในเศษวัสดุเหลือทิ้งทางการเกษตร ได้แก่ เปลือกข้าวโพด ชานอ้อย ฟางข้าง ซังข้าวโพดและรำข้าวได้ดี เช่นเดียวกับการย่อยไซแลนในเยื่อกระดาษคราฟท์ชนิดต่างๆ ได้แก่ เยื่อชานอ้อยเยื่อยูคาลิปตัส และเยื่อสน ไซลาเนส I และไซลาเนส II ขนาด 23.0 และ 47.0 กิโลดาลตัน จาก crude enzyme ถูกทำให้บริสุทธิ์ ด้วย DEAE-Toyopearl DEAE-Hiprep FF16/10 and Mono-Q HR5/5 โครมาโตกราฟฟี่ ไซลาเนส I ที่บริสุทธิ์ ทำงานได้ดีที่พีเอช 7.0 ขณะที่ไซลาเนส II ทีบริสุทธิ์ ทำงานได้ดีอยู่ในช่วงพีเอช 5.0-9.0 ทั้งสองไซลาเนสบริสุทธิ์มีเสถียรภาพดีในช่วงพีเอชค่อนข้างกว้าง ไซลาเนส I ที่บริสุทธิ์ ทำงานได้ดีที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส ขณะที่ไซลาเนส II ที่บริสุทธิ์ ทำงานได้ดีที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส และมีเสถียรภาพต่ออุณหภูมิดีกว่าไซลาเนส I ที่บริสุทธิ์ ค่า Km และ Vmax ของไซลาเนส I ที่บริสุทธิ์ เท่ากับ 4.33 mg/mlและ 63.5 umolmin -1 mg-1 ตามลำดับ ขณะที่ค่า Km ของไซลาเนส II ที่บริสุทธิ์ เท่ากับ 0.30 mg/ml และ Vmax เท่ากับ 210 umolmin -1 mg-1 ไซลาเนสบริสุทธิ์ทั้ง 2 ชนิด เป็นเอ็นโดไซลาเนส แต่มี mode of action แตกต่างกัน ซึ่งผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากการย่อย soluble oat spelt xylan โดยไซลาเนสบริสุทธิ์ทั้ง 2 ชนิดแตกต่างกัน การทำงานร่วมกันระหว่างสองไซลาเนสบริสุทธิ์พบว่าน้ำตาลรีดิวซ์ที่ถูกปลดปล่อยออกมาเพิ่มขึ้นร้อยละ 116 เมื่อเปรียบเทียบกับการทำงานแยกกันระหว่างไซลาเนสบริสุทธิ์ของแต่ ละชนิดไซลาเนสที่ผลิตจาก alkaliphilic Bacillus sp. K-8 ถูกทำให้บริสุทธิ์อย่างง่ายภายในขั้นตอนเดียวโดยใช้สับสเตรทที่ไม่ละลายน้ำ ซึ่งพีเอช อุณหภูมิ และน้ำตาลรีดิวซ์ที่เกิดจากการย่อยสลายมีผลต่อการยึดเกาะของไซลาเนสกับเปลือกข้าวโพด สารประเภท mild denaturant เช่น ยูเรีย sodium dodecyl sulphate น้ำตาลรีดิวซ์ และ triethylamine มีผลต่อการหลุดออกของไซลาเนสจาก xylanase-corn husk complex ไซลาเนสจาก Bacillus sp. K-8 ถูกทำให้บริสุทธิ์ โดยอาศัยหลักการยึดเกาะและหลุดออกอย่างจำเพาะกับคอลัมน์เปลือกข้าวโพด ภายใต้สภาวะการป้องกันการเกิดผลิตภัณฑ์น้ำตาล ที่พีเอชและอุณหภูมิต่ำระหว่างขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ การวิเคราะห์กรดอะมิโนทางด้านปลาย N ของ xylan-binding xylanse ที่ผลิตจาก B. firmus K-1 พบว่ามีการเรียงลำดับเป็น Lys-Phe-Val-Thr-Lys-Val-Leu-Thr-Val-Val-Ile-Ala ยีน xbx ของ xylan-binding xylanase เมื่อถูกโคลนและแสดงออกใน Escherichia coli พบว่ามีลำดับดีเอ็นเอจำนวน 633 เบส ซึ่งสามารถถอดรหัสเป็นโพลีเปป์ไทด์ได้ 210 หน่วย มีมวลโมเลกุล 19.8 กิโลดาลตัน โดย recombinant xylanase สามารถย่อยสลายพันธะ B-1, 4-glycosidic ของไซแลนและยึดเกาะกับไซแลนที่ไม่ละลายน้ำได้ดี นอกจากนี้จากการศึกษาโครงสร้างสามมิติของ xylan-binding xylanase โดยวิธี homology modeling พบว่ามีความคล้ายคลึงกับโครงสร้างสามมิติของไซลาเนส จาก Bacillus circulans [1BVV.pdb]

King Mongkut's University of Technology Thonburi

Address: BANGKOK

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: Khanok Ratanakhanokchai

Role: Advisor

Name: Khin Lay Kyu

Role: Advisor

Name: กนก รัตนะกนกชัย

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Name: คิน เลย์ คู

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Created: 2005

Modified: 2019-06-24

Issued: 2551-07-03

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

text/plain

ISBN: 9741849524

CallNumber: BCT145

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemical Technology

Grantor: King Mongkut's University of Technology Thonburi

©copyrights King Mongkut's University of Technology Thonburi

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	BCT145.pdf	5.86 MB	110	2024-07-17 11:40:50
2	BCT145ab.pdf	166.53 KB	29	2018-05-10 19:27:36
3	BCT145aben.txt	4.18 KB	37	2018-05-10 19:27:36
4	BCT145abth.txt	8.58 KB	17	2018-05-10 19:27:37

ใช้เวลา

0.045623 วินาที