สภาวะที่เหมาะสมในการผลิตสารตั้งต้นสเตียรอยด์จากสเตียรอลพืช โดย Mycobacterium fortuitum

Optimal conditions for the prodection of steroid precursors from plant sterols by Mycobacterium fortuitum

Name: บุปผา หลักเรืองทรัพย์

ThaSH: สารตั้งต้นสเตียรอยด์

ThaSH: สเตียรอยด์

ThaSH: ไมโคแบคทีเรียม ฟอร์ทิวอิทัม

ThaSH: สเทอรอยด์ฮอร์โมน

Abstract: งานวิจัยนี้ศึกษาสภาวะที่เหมาะสมในการเจริญของ Mycobacterium fortuitum CBS 313.79 และการผลิตสารตั้งต้นสเตียรอยด์จากสเตียรอลพืชโดยจุลินทรีย์ดังกล่าว พบว่า อาหารเลี้ยงหัวเชื้อที่เหมาะสมสำหรับการเจริญ คือ นิวเตรียนบรอท ที่เสริมด้วย 1.0 กรัม/ลิตร ผงสกัดยีสต์ 5.0 กรัม/ลิตร กลีเซอรอล และ 1.0 กรัม/ลิตร ทวีน 80 อาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสมสำหรับเปลี่ยนสเตียรอลพืชไปเป็นสารตั้งต้นสเตียรอยด์ คือ 4-แอนโดรสตีน-3, 17-ไดโดน (AD) ประกอบด้วยสารละลายแป้งที่ย่อยด้วยเอนไซม์เทอร์มามิล ซึ่งมีปริมาณน้ำตาลรีดิวส์ 20.8% (นน./นน.) หรือปริมาณกลูโคส 0.8% (นน./นน.) และมีปริมาณของแข็งทั้งหมด (total solid content) 5.0 กรัม/ลิตร เป็นแหล่งคาร์บอน (NH₄)₂HPO₄ ที่ความเข้มข้นของไนโตรเจนทั้งหมดเป็น 0.50 กรัม/ลิตร KH₂PO₄ 0.50 กรัม/ลิตร CaCo₃ 3.0 กรัม/ลิตร MgSO₄ 2.0 กรัม/ลิตร NaCL 0.4 กรัม/ลิตร และสารละลายสเตียรอลพืชในคลอโรฟอร์มที่ความเข้มข้น 0.84 มก./มล. ของอาหารเลี้ยงเชื้อเป็นสารตั้งต้น และปรับ pH ของอาหารเลี้ยงเชื้อเป็น 7.0-8.0 ภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงที่เหมาะสม คือ เขยทา 200 รอบต่อนาที ที่ 30 ̊ซ. เป็น เวลา 5 วัน จะให้การเปลี่ยนสเตียรอลเป็น AD สูงสุด 83.6% งานวิจัยนี้ยังรายงานวิธีที่เหมาะสมในการสกัดแยก AD ออกจากน้ำหมักและทำให้บริสุทธิ์ พบว่า ตัวทำละลายที่เหมาะสมในการสกัด คือ เอทธิลอะซีเตท ในอัตราส่วนน้ำหมัก:เอทธิลอะซีเตท เท่ากับ 1:2 (ปริมาตร/ปริมาตร) การสกัดทำซ้ำ 2 ครั้ง ครั้งละ 15 นาที สามารถสกัด AD ออกมาได้ 97.99% ของปริมาณที่มีอยู่ในน้ำหมัก การทำ AD ให้บริสุทธิ์ใช้วิธีโครมาโตกราฟีบนซิลิกาเจลคอลัมน์ 2 ครั้ง โดยครั้งแรกชะด้วย เอทธิลอะซีเตท:คลอโรฟอร์ม ในอัตราส่วน 15:85 (ปริมาตร/ปริมาตร) นำสารที่ได้มาทำให้บริสุทธิ์ยิ่งขึ้นโดยผ่านซิลิกาเจลคอลัมน์ที่ 2 ซึ่งชะด้วย ไซโคลเฮกเซน:เอทธิลอะซีเตท ในอัตราส่วน 4:1 (ปริมาตร/ปริมาตร) ระเหยตัวทำละลายออก และตกผลึกสารประกอบที่ได้ด้วยตัวทำละลายผสม คือ เอทธิลอะซีเตทกับเฮกเซน ได้ผลึกสีขาวที่มีความบริสุทธิ์ 97% และได้ผลิตผล 18.6% ผลการวิเคราะห์ทางเคมีของสารประกอบที่ได้เปรียบเทียบกับสารมาตรฐาน AD พบว่า ข้อมูลการวิเคราะห์จุดหลอมเหลว แมสสเปกโตรสโคปี อินฟราเรดสเปกโตรสโคปี และโปรตอน-นิวเคลียร์แมกเนติกเรโซแนนซ์ ยืนยันว่าสารประกอบที่ได้คือ 4-แอนโดรสตีน-3, 17-ไดโอน

Abstract: Optimal conditions for growth and bioconversion of plant sterol into steroid intermediate by Mycobacterium fortuitum CBS 313.79 were investigated. The suitable medium compositions for inoculums were nutrient broth supplemented with 1.0 g/l yeast extract, 5.0 g/l glycerol and 1.0 g/l tween 80. The optimal medium compositions for bioconversion of plant sterol into steroid intermediate, 4-androstene-3, 17-dione (AD), consisted of termarmyl-hydrolyzed starch having 20.8% (w/w) of reducing sugar or 0.8% (w/w) of glucose with 5.0 g/l of total solid content as a carbon source, (NH₄)₂HPO₄ at a total nitrogen content of 0.50 g/l as a nitrogen source, 0.50 g/l of KH₂PO₄, 3.0 g/l of CaCo₃, 2.0 g/l of MgSO₄, 0.4 g/l of NaCl and plant sterol dissolved in chloroform at 0.84 mg/ml of the medium as a substrate. The medium was adjusted to pH 7.0-8.0. Under the suitable growth conditions which were at 30℃ with 200 rpm shaking for 5 days, 83.6% bioconversion of sterol to AD was obtained. Furthermore, conditions for extraction and purification of AD from the fermentation broth were also reported. The suitable solvent for extracting was ethylacetate. The ratio between culture broth and the solvent was 1:2 (v/v). Extractionwas carried out 2 times for 15 minutes each. Under these conditions, 97.99% of AD with respect to the amount present in the broth was recovered. It was purified by chromatography on silica gel column twice. The first silica gel column chromatography was eluted with a mixture of ethylacetate and chloroform at a ratio of 15:85 (v/v). The eluent was further chromatographed on a second silica gel column eluted with cyclohexane mixed with ethylacetate at a ratio of 4:1 (v/v). The eluent was evaporate. AD was crystallized by using the mixed solvent of ethylacetate and hexane. White crystal was obtained with 18.6% recovery and 97% purity. Chemical analyses of the crystal in comparison with standard AD which were melting point, mass spectroscopy, infrared spectroscopy and proton-nuclear magnetic resonance confirmed that the compound obtained was 4-androstene-3, 17-dione.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: ไพเราะ ปิ่นพานิชการ

Role: ที่ปรึกษา

Name: นลิน นิลอุบล

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2534

Modified: 2561-11-14

Issued: 2561-08-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/34370

ISBN: 9745785717

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เทคโนโลยีทางชีวภาพ

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Buppa_la_front.pdf	3.94 MB	1	2021-09-03 10:48:22
2	Buppa_la_ch1.pdf	6.29 MB	1	2021-09-03 10:49:14
3	Buppa_la_ch2.pdf	4.11 MB	1	2021-09-03 10:48:06
4	Buppa_la_ch3.pdf	13.34 MB
5	Buppa_la_ch4.pdf	3.43 MB
6	Buppa_la_back.pdf	6.44 MB

ใช้เวลา

0.037989 วินาที