การพัฒนาเทคนิคโอลิโกนิวคลีโอไทด์อาร์เรย์เพื่อตรวจเชื้อก่อโรค ปนเปื้อนในนม

DEVELOPMENT OF OLIGONUCLEOTIDE ARRAY FOR FOODBORNE PATHOGEN DETECTION IN MILK

Name: ชนิดา กุประดิษฐ์

Name: จิรายุส วรรัตนโภคา

Name: ศศิธร อินทร์นอก

Name: มารินา เกตุทัต-คาร์นส์

keyword: เชื้อก่อโรคในอาหาร

; มัลติเพล็กซ์พีซีอาร์

; โอลิโกนิวคลิโอไทด์อาร์เรย์

; โพรบ

; น้ำนม

; Foodborne pathogens

; Multiplex PCR

; Oligonucleotide array

; Probes

; Fresh milk

Abstract: นมและผลิตภัณฑ์นมเป็นแหล่งการปนเปื้อนของเชื้อก่อโรคได้หลายชนิด โดยเฉพาะอย่าง ยิ่ง Bacillus cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. และ Staphylococcus aureus ดังนั้นจึงควรพัฒนาวิธีการที่รวดเร็วซึ่งสามารถตรวจเชื้อก่อโรคทั้ง 5 เชื้อนี้ ได้พร้อม ๆ กัน ในงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาการใช้เทคนิคมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ ซึ่งใช้ยีนที่มี ความจำเพาะเป็นยีนเป้าหมายร่วมกับเทคนิคโอลิโกนิวคลิโอไทด์อาร์เรย์ทำให้สามารถตรวจเชื้อก่อ โรคในนมได้ โพรบที่มีความเหมาะสมในการตรวจเชื้อทั้ง 5 เชื้อถูกคัดเลือกโดยใช้เทคนิคการติด ฉลากดีเอ็นเอเป้าหมายด้วยวิธี post-PCR labeling ซึ่งสามารถสังเกตสัญญาณที่เกิดไฮบริไดเซชั่น ได้ ด้วยตาเปล่า โดยเชื้อเป้าหมายที่ใช้ในการทดสอบเทคนิคที่พัฒนาขึ้นคือ B. cereus, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp. และ S. aureus ผลการทดลองพบว่ายีนที่เหมาะสมในการทำมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์คือ enterotoxin FM, uspA, prfA, fimY และ eap โดยให้ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่มีความจำเพาะขนาด 513, 884, 398, 315 และ 230 bp ซึ่งพบในเชื้อ B. cereus, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp. และ S. aureus ตามลำดับ โดยความเข้มข้นของไพร์เมอร์ที่เหมาะสมในการทำมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์คือ 0.04 μM enterotoxin FM, 0.12 μM uspA, 0.16 μM prfA, 0.04 μM fimY และ 0.2 μM eap นอกจากนี􀃊ยังพบว่า ที่สภาวะดังกล่าวไม่พบการเกิดปฏิกิริยาข้าม (cross-reactivities) กับเชื้อที่ไม่ใช่เชื้อเป้าหมายที่แยก ได้จากน้ำนมด้วย หลังจากนำผลิตภัณฑ์ที่ได้จากมัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ไปทำให้บริสุทธิ์ และติดฉลาก จากนั้นนำไปไฮบริไดซ์กับโพรบเพื่อคัดเลือกโพรบที่มีความจำเพาะ พบว่ารูปแบบการเกิดไฮบริได เซชั่น ของเชื้อ B. cereus และ S. aureus มีความแตกต่างกันระหว่างเชื้อมาตรฐานและเชื้อที่แยกได้ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าลำดับนิวคลิโอไทด์ในดีเอ็นเอเป้าหมายของเชื้อดังกล่าวเกิดการแปรผันทาง พันธุกรรม ดังนั้นจึงเลือกทั้ง 5 โพรบสำหรับใช้ในการตรวจเชื้อดังกล่าวในขั้นต่อไป สำหรับการ ตรวจเชื้อ E. coli, L. monocytogenes และ Salmonella spp. คัดเลือกโพรบ EC1-EC5 (33-100% accuracy), LM1-LM4 (12.5-100% accuracy) และ SM1-SM3 (33-100% accuracy) ตามลำดับ เพื่อ ใช้ในการตรวจเชื้อดังกล่าวในขั้นต่อไป งานในขั้นต่อไปจะหาสภาวะที่เหมาะสมในการเพิ่มปริมาณเชื้อเป้าหมายทั้งหมดจาก น้ำนมในอาหาร enrichment จากนั้นจะเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายจากแต่ละเชื้อด้วยเทคนิค มัลติเพล็กซ์พีซีอาร์ตามด้วยการติดฉลากและไฮบริไดเซชั่น กับโพรบที่มีความเหมาะสมจากงานวิจัย นี้ สุดท้ายเทคนิคที่พัฒนาขึ้นนี้จะถูกใช้ในการตรวจเชื้อหลายเชื้อในตัวอย่างน้ำนม และประเมินค่า ความแม่นยำและค่าความไวของเทคนิคที่พัฒนาขึ้น

Abstract: Milk and dairy products can harbor varieties of foodborne pathogens especially Bacillus cereus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., and Staphylococcus aureus. A rapid method for simultaneous detection of five major foodborne pathogens in milk was developed. In this investigation, the combination of multiplex PCR (m-PCR) using specific genes as targets and oligonucleotide array hybridization were performed to specifically detect dominant foodborne pathogens in milk. The suitable probes for specific detection of five foodborne pathogens were screened and selected using post-PCR labeled target regions. Target bacteria including B. cereus, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., and S. aureus were used as models for the evaluation of these combined methods. The hybridization signals of non-radioactive labeling digoxigenin (DIG) incorporated into the PCR target regions were observed by naked eyes. M-PCR targeting the enterotoxin FM, uspA, prfA, fimY, and eap genes were successfully used to detect B. cereus, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., and S. aureus, respectively. The optimum concentrations of the primers in the m-PCR reaction were 0.04 μM enterotoxin FM, 0.12 μM uspA, 0.16 μM prfA, 0.04 μM fimY, and 0.2 μM eap primers. The expected PCR products of 513, 884, 398, 315, and 230 bp were detected from the specific amplification of B. cereus, E. coli, L. monocytogenes, Salmonella spp., and S. aureus, respectively. Cross amplification from non-target bacteria isolated from raw milk samples were not detected. The target regions of m-PCR amplified products were purified, labeled, and used for specific probe selection. After hybridization, the difference of hybridization patterns were observed among isolated and reference strains of B. cereus and S. aureus. These results indicated that their target regions should contained the variation of nucleotide sequences. Therefore, all five probes of B. cereus and S. aureus were selected for further application step. For specific detection of E. coli, L. monocytogenes, and Salmonella spp., high accuracy of specific probes, including EC1-EC5 (33-100% accuracy), LM1-LM4 (12.5-100% accuracy) and SM1-SM3 (33- 100% accuracy), were selected for detection of E. coli, L. monocytogenes, and Salmonella spp., respectively. For further works, optimization of the enrichment steps of all target bacteria from milk sample will be performed. Then, the DNA target regions of each bacterium will be amplified by m-PCR follow by hybridization with the suitable probes obtained from this work. Finally, the developed method will be applied to detect multiple pathogens in milk sample. The accuracy and sensitivity of the developed method will be measured. Keywords

มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน. สำนักวิทยบริการและเทคโนโลยีสารสนเทศ

Address: นครราชสีมา

Email: kitiya.ni@rmuti.ac.th

Name: มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคลอีสาน.

Role: ผู้ให้ทุน

Created: 2559

Modified: 2561-06-07

Issued: 2561-06-07

งานวิจัย/Research report

application/pdf

tha

©copyrights มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีราชมงคล อีสาน

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	RMUTI_Res49-61.pdf	22.14 MB	14	2024-08-08 23:12:30

ใช้เวลา

0.022493 วินาที