การเพิ่มประสิทธิภาพของการสังเคราะห์เพนนิซิลิน เอซิเลส ใน โปรเตียส เรทเกอไร

Enhancement of penicillin acylase bioynthesis in proteus rettgeri

Name: สมศักดิ์ สรั่งบิน

ThaSH: แบคทีเรีย

Abstract: เพนนิซิลิน เอซิเลส (E.C. 3.5.1.11) เป็นเอนไซม์เร่งปฎิกิรยาการไฮโดรไลซ์ เพนนิซิลิน จี ให้กรด 6-อะมิโนเพนนิซิลานิก ซึ่งนิยมใช้เป็นสารต้นตอในการกระบวนการสังเคราะห์อนุพันธ์ เพนนิซิลิน จุดประสงค์ของการวิจัยนี้เพื่อศึกษาธรรมชาติของแหล่งต้นตอคาร์บอนที่เหมาะสมต่อการผลิต เอนไชม์เพนนิซิลน เอซิเลส ใน P. rettgeri ATCC 9250 ตลอดจนเปรียบเทียบคุณสมบัติ เอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส P. rettgeri ATCC 9250 WT และมิวแทนท์ SPS-6 ซึ่งสามารถเจริญในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีกลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอนเดี่ยวได้ เมื่อเจริญ P. rettgeri ATCC 9250 ที่อุณหภูมิ 28 องศาเซลเซียส ในอาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วย แอสปาร์เตท 0.8 เปอร์เซ็นต์ ให้ค่าการเจริญ (OD 540) สูงสุด 4.5 หน่วย แอคติวิตี สูงสุดของเอนไซม์ เพนนิซิลิน ประมาณ 173 หน่วย ต่อ มิลลิกรัมโปรตีนรวมของเซลล์ สารต้นตอคาร์บอนคู่ที่เหมาะสมต่อการเจริญและผลิตเอนไชน์คือ ซิเตรต 0.2% ร่วมกับ กลูโคส 1.0% ให้ค่าการเจริญ และผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส สูงสุด 3.6 หน่วย และ 98 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนรวมของเซลล์ ตามลำดับ P. rettgeri สายพันธุ์นี้ไม่สามารถใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอคาร์บอนเดี่ยว ดังนั้นจึงเป็นที่น่าสนใจที่จะแยกมิวแทนท์ ซึ่งสามารถใช้กลูโคสเป็นแหล่งต้นตอของคาร์บอนได้ การกลายพันธุ์ P. rettgeri ATCC 9250 ด้วย NTG สามารถแยกมิวแทนท์ซึ่งใช้กลูโคสเป็นสารต้นตอของคาร์บอนเดี่ยวได้ 9 ตัว มิวแทนท์ SPS-6 สามารถเจริญและผลิตเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ได้สูงในอาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วยกลูโคส 0.4% ค่าแอคติวิตีสูงสุดของเอนไชม์ ประมาณ 397 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนรวมของเซลล์ และค่าการเจริญสูงสุด 4.6 หน่วย เมื่อทำการศึกษาเปรียบเทียบคุณสมบัติของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ของสายพันธ์ P. rettgeri ATCC 9250 WT กับ มิวแทนท์ SPS-6 พบว่า พี เอช ที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยา การไฮโดรไลซ์ เพนนิซิลิน จี ของเอนไซม์ เพนนิซิลิน เอซิเลส เซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ มิวแทนท์ SPS-6 มีค่าอยู่ในช่วงใกล้เคียงกันประมาณ 7.0-8. 5 อย่างไรก็ตาม ค่าอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฎิกิริยาของเอนไซม์จากสายพันธุ์ทั้ง 2 จะแตกต่างกัน อุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานของเอนไซม์มีค่า 450 ซ. สำหรับเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ 55o ซ. สำหรับเซลล์มิวแทนท์ SPS-6 เอนไซม์ เพนนิซิลน เอซิเลส ของเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ มิวแทนท์ SPS-6 มีความทนทานต่อสภาวะที่เป็นกรดและด่างมากได้ต่ำ สามารถเก็บเอนไซม์ไว้ที่ 370 ซ. นาน 5 ชั่วโมง โดยไม่มีการสูญเสียแอคติวิตี ค่า Km ต่อเพนนิซิลิน จี ของ เอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส ในเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และมิวแทนท์ SPS-6 มีค่า 9.0 และ 5.6 มิลลิโมลาร์ กรดฟีนิลอะซีติก สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์แบบแข่งขัน (Competitive inhibition) ให้ค่า Ki สำหรับเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และมิวแทนท์ SPS-6 เท่ากับ 5.0 และ 7.0 มิลลิโมลาร์ ตามลำดับ การยังยั้งการทำงนของเอนไชม์ด้วนกรด 6ลอะมิโนเพนนิซิลานิก เป็นแบบไม่แข่งขัน (non-competitive inhibition) มีค่า Ki 7.6 มิลลิโมลาร์ สำหรับเซลล์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ 8.8 มิลลิโมลาร์ สำหรับเซลล์ มิวแทนท์ SPS-6 สายพันธุ์ P. rettgeri ATCC 9250 WT และ มิวแทนท์ SPS-6 สามารถเก็บรักษาไว้ในสารละลายนอร์มอลซาลีน ที่อุณหภูมิ 40 ซ. ได้นาม 45 วัน พบว่า แอคติวิตีของเอนไซม์เพนนิซิลิน เอซิเลส จะยังคงเหลืออยู่ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ ของ แอตติวิตีเริ่มต้น ยิ่งไปว่านั้นที่สภาวะเดียวกันนี้ มิวแทนท์ SPS-6 สามารถดำรงคุณสมบัติของการเจริญและผลิตเอนไชม์เพนนิซิลน เอซิเลส ได้สูง นานมากกว่า 7 เดือน

Abstract: Penicillin acylase (E.C. 3.5.1.11) catalyzes the hydrolysis of Penicillin G yielding a widely used 6-aminopenicillanic acid (6-APA) as the starting material for further synthesis of penicillin derivatives. The aim of this project was to study the nature of carbon source suitable for the maximum activity of penicillin acylase (PAase) biosynthesis in Proteus rettgeri ATCC 9250, plus a comparative studies of the properties of PAase between WT and a mutant strain that showed a different ability in using glucose as the sole carbon source. It was found that aspartate functioned as the best sole carbon source providing the maximal PAse activity as high as 173 unit per mg total cell protein at the highest growth of 4.5 unit at OD540. Viewed as the best combination of dual carbon sources, it was found that 0.2% citrate plus 1% glucose rendered the maximum activity of PAase was 98 unit per mg total cell protein at its highest growth of 3.6 unit OD540. Noted that, this strain of Proteus rettgeri could not use glucose as the sole carbon source. Therefore, it was interesting to isolate strains where glucose utilizable ability was regained. Mutation of P. rettgeri ATCC 9250 with NTG resulted in 9 mutants with the ability to utilize glucose as a sole carbon source. One of them, named SPS-6, was able to synthesize penicillin acylase with the maximal activity of 397 units per mg of total cell protein in minimal medium with 0.4 to glucose at its highest cell turbidity of 4.6 units. Comparative studies on the properties of penicillin acylase produced by the WT strain and SPS-6 mutant were carried out. The optimal pH for the hydrolysis of Pen G for the enzyme from both sources was in the same range of pH 7.0-8.5. However, a difference in the optimal reaction temperature was observed. The optimal temperatures for penicillin acylase from the WT and SPS-6 were 45℃ and 55℃, respectively, Both enzymes were less stable to extreme acidic and basic conditions. Cells storage at 37℃ for 5 hours did not affect the loss of the enzyme activity. The Km values of the enzyme from the WT and SPS-6 for the hydrolysis of Pen G were 9.0 and 5.6 mM, respectively. When phenylacetic acid was used as a competitive inhibiter, the Ki values of the enzyme from the WT and SPS-6 were 5.0 and 7.0 mM, respectively. With 6-APA as a non-competitive inhibitor, the Ki values for the enzyme from the WT and SPS-6 were 7.6 and 8.8 mM, respectively. Both strains could be maintained in normal saline solution at 4℃ for longer than 45 days with 80% of the intial activity still remained. Furthermore, under this storage conditions, SPS-6 could maintain high ability of cell growth and penicillin acylase production for at least 7 months.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: สัณห์ พณิชยกุล

Role: ที่ปรึกษา

Name: ไพเราะ ทิพยทัศน์

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2530

Modified: 2561-05-02

Issued: 2561-05-02

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9745680788

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/48383

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: ชีวเคมี

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Somsak_sa_front.pdf	14.27 MB	1	2025-01-18 13:59:09
2	Somsak_sa_ch1.pdf	3.78 MB
3	Somsak_sa_ch2.pdf	12.99 MB
4	Somsak_sa_ch3.pdf	9.27 MB
5	Somsak_sa_ch4.pdf	10.79 MB
6	Somsak_sa_back.pdf	3.63 MB

ใช้เวลา

0.047272 วินาที