การแยกให้บริสุทธิ์และการศึกษาสมบัติของแอลคาไลน์โปรตีเอสจากเชื้อ Bacillus Subtilis TISTR 25

Purification and characterization of alkaline protease from Bacillus subtilis TISTR 25

Name: ปกรณ์ จิโรจน์กุลกิจ

ThaSH: บาซิลลัสซับทิลิส

Abstract: Bacillus subtilis TISTR 25 เป็นแบคทีเรียที่แยกได้จากดินในประเทศไทย สามารถถูกชักนำให้ผลิตเอนไซม์โปรตีเอสสูงขึ้นได้โดยเลี้ยงที่อุณหภูมิ 30 ̊ซ ในอาหารสูตรปรับต่ำที่เสริมด้วย 1 เปอร์เซนต์กลูตาเมท pH 6.0 และพบว่าการผลิตเอนไซม์โปรตีเอส ถูกกดดันในสภาวะที่มีน้ำตาลกลูโคสด้วยกระบวนการคาตาบอไลต์ รีเพรสชัน โดยการศึกษาผลของ Ethylenediamine tetraacetic acid และ Phenylmethylsulfonyl fluoride ต่อเอนไซม์แอคติวิตี พบว่าเอนไซม์โปรตีเอสที่แยกได้ในน้ำเลี้ยงเชื้อ ประกอบด้วยนิวทรัลและแอลคาไลน์โปรตีเอสในอัตราส่วนประมาณ 1:3 ซึ่งต่างจากเชื้อมาตรฐาน B. licheniformis ATCC 21415 ที่สร้างเอนไซม์แอลคาไลน์โปรตีเอสเป็นส่วนใหญ่ เมื่อตกตะกอนโปรตีนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต และแยกโดย CM-cellulose คอลัมน์โครมาโตกราฟฟี เอนไซม์แอลคาไลน์โปรตีเอสจากสายพันธุ์ TISTR 25 มีความบริสุทธิ์ขึ้น 2.3 เท่า จากการศึกษาสมบัติของแอลคาไลน์โปรตีเอสที่มีความบริสุทธิ์บางส่วนนี้ พบว่า เอนไซม์เป็นโพลีเพปไทด์สายเดี่ยว ไม่มีหน่วยย่อย และมีน้ำหนักโมเลกุล 27,000 ดาลตัน pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยาคือ 8.5 และ 55 ̊ซ เอนไซม์ไฮโดรไลส์ได้ทั้งสับสเตรตธรรมชาติและสับสเตรตสังเคราะห์ โดยมีค่า K[subscript m] ต่อ casein, hemoglobin และ benzoyl tyrosine ethyl ester (BTEE) เท่ากับ 0.02, 0.07 และ 8.0 มิลลิโมล/ลิตร ตามลำดับ และมีค่า K[subscript m] ต่อ azocasein, azocoll คือ 3.03 และ 33.33 มก./มล. เอนไซม์มีความจำเพาะในการไฮโดรไลส์พันธะเพปไทด์ที่ปลายคาร์บอกซิลของกรดอะมิโน อาร์จินีน อะลานีน ลูซีน เฟนิลอะลานีน และเวลีน แอลคาไลส์โปรตีเอสที่แยกได้จาก B. subtilis TISTR 25 นี้ มีสมบัติบางประการต่างจากเอนไซม์ Subtilisin Carlsberg คือ pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเร่งปฏิกิริยา รวมทั้งแอฟฟินิตีต่อ casein และ BTEE ซึ่งคาดว่าเอนไซม์ทั้งสอง อาจมีส่วนประกอบกรดอะมิโนในบริเวณ binding site ต่างกัน เมื่อศึกษาความจำเพาะของเอนไซม์ในการไฮโดรไลส์พันธะเพปไทด์ โดยการวิเคราะห์ด้วยวิธีสเปคโตรโฟโตเมตรี และ TLC พบว่า เอนไซม์ที่แยกได้มีความจำเพาะไม่ต่างจากเอนไซม์ Subtilisin Carlsberg และ Nagarse แต่ต่างจากเอนไซม์ Trypsin ในสภาวะที่ทำการทดลอง

Abstract: A chemical-defined medium supplemented with 0.1 percent glutamate at pH 6.0 and 30℃ were the most suitable culturing condition for the production of extracellular proteases by a local strain of Bacillus, B. subtilis TISTR 25. Glucose was found to have a pronounce effect on the protease production through catabolite repression. Through the use of the enzyme inhibitors, phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), the results suggested that the enzyme excreted by the strain TISTR 25 are combination of neutral and alkaline proteases in the approximate ratio of 1:3. The culture thus differs from the standard strain of B. licheniformis ATCC 21415 which mostly produced alkaline protease. Alkaline protease from B. subtilis TISTR 25 was purified 2.3 fold by using ammonium sulfate precipitation and CM-cellulose chromatography. The purified enzyme was proved to be a monomer with a molecular weight of 27,000. The optimum pH and the optimum temperature were 8.5 and 55 ℃, respectively. The enzyme was able to hydrolyse both natural and synthetic substrates. The K[subscript m] for casein, hemoglobin and benzoyl tyrosine ethyl ester (BTEE) were 0.02, 0.07 and 8.0 mmol/l whereas those of azocasein and azocoll were 3.03 and 33.33 mg/ml, respectively. The enzyme hydrolysed peptide bond specifically at the carboxyl end of the amino acid arginine, alanine, leucine, phenylalanine and valine. This purified alkaline protease differs from Subtilisin Carlsberg in its optimum pH and temperature for catalysis. The two enzymes also differ in their affinities to casein and BTEE, the result of which suggests that some amino acids around the vicinity of the binding site of the two enzymes might be different. The result from peptide hydrolysis as analyzed by spectrophotometric and TLC technique indicated that the pattern of specificity of peptide hydrolysis of this alkaline protease is similar to that of Subtilisin Carlsberg and Nagarse but differs from trypsin.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: เปี่ยมสุข พงษ์สวัสดิ์

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2532

Modified: 2560-12-28

Issued: 2560-12-27

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9745763381

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: ชีวเคมี

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Prakorn_gi_front[1].pdf	5.08 MB	2	2020-02-16 15:46:27
2	Prakorn_gi_ch1[1].pdf	5.32 MB	1	2020-02-16 15:47:29
3	Prakorn_gi_ch2[1].pdf	1.45 MB	1	2020-02-16 15:46:51
4	Prakorn_gi_ch3[1].pdf	8.53 MB	1	2019-07-18 16:05:46
5	Prakorn_gi_ch4[1].pdf	17.86 MB
6	Prakorn_gi_ch5[1].pdf	8.25 MB
7	Prakorn_gi_back[1].pdf	4.35 MB

ใช้เวลา

0.038037 วินาที