Detection of white spot and yellow-head viruses in Penaeus monodon by amplification of conserved sequences

การตรวจสอบไวรัสจุดขาวและไวรัสหัวเหลืองในกุ้งกุลาดำโดยการขยายยีนในส่วนของลำดับอนุรักษ์

Name: Wansika Tongchuea

LCSH: Penaeus monodon -- Viruses

LCSH: Shrimp culture

Abstract: Shrimp aquaculture has expanded rapidly in Thailand since the 1980s. In 1994 total export production totaled 248,000 metric tons and brought in foreign exchange revenue of billions of dollars. Although the shrimp culture industry is undergoing rapid development in a number of Asian countries, successful production is increasingly hampered by many factors, including environmental pollution, poor management and disease. Two new viruses, Systemic Ectodermal and Mesodermal Baculovirus (SEMBV) or White Spot Baculovirus (WSBV) and Yellow-Head virus (YHV), presently overshadow all other agents as the leading causes of major production losses in black tiger shrimp (Penaeus monodon). The present study was intended to develop sensitive and specific procedures for SEMBV and YHV detection. SEMBV or WSBV was first reported as an accidental infection in laboratory reared shrimp in early 1994. An examination by transmission electron microscopy (TEM) revealed enveloped, bacilli form virions with a distinctive multifibrillar appendage that measured 276 x 121 nm (excluding the appendage). This virus was placed in Baculovirus group. In this study, SEMBV DNA was used as a template for polymerase chain reaction (PCR) amplification of viral DNA fragments. PCR primers were designed from regions of conserved amino acid sequence in the polyhedrin genes of baculoviruses. A 473 bp PCR product was obtained. This DNA fragment was ligated to pUC18 plasmid and cloned into E coli DH5α. Clone no.l was selected and sequenced because it hybridized strongly to SEMBV DNA. The 473 bp inserted fragment of clone no.l was used as a probe in in situ hybridization. The probe were able to hybridize with SEMBV infected P. monodon but not with MBV and YHV infected specimens. A set of PCR primers derived from a cloned SEMBV DNA fragment was designed to amplify a 236 bp SEMBV-specific DNA fragment. No cross reaction was observed with other shrimp viruses. Two other sets of primers designed from SEMBV genomic sequence and from authentic IL-lα mRNA were combined with the first set of primers to confirm the PCR reaction: The limits of detection using purified DNA and crude DNA as templates were 10 fg in PCR using either one set of primers or three sets of primers. Detection in field samples using PCR with one set of primers or three sets of primers gave the same results. Yellow-head virus (YHV) was first reported in Thailand in 1992 when it caused pond-side losses of approximately 30 million US dollars. The morphology of negatively stained virions by TEM and nucleic acid preparation from purified YHV indicated that YHV was an RNA virus. Purified YHV-RNA was used as a template for reverse transcription and PCR amplification (RT-PCR). RT-PCR primers were designed from regions of conserved amino acid sequence in the L(polymerase) protein gene of Rhabdoviruses. A 450 bp RT-PCR product was obtained. This 450 bp product was ligated to pUC18 plasmid and cloned into E coli DH5α. The inserted fragments from clone no.10 and clone no.20 were selected and sequenced because they hybridized strongly to YHV-RNA. Using the selected sequences, a set of RT-PCR primers was designed to amplify a 151 bp YHV-specific RNA fragment. No cross reaction was observed with other shrimp viruses. The limit of detection was 5 fg of purified RNA. A comparative study of RT-PCR and H&E staining methods for detection of YHV in experimentally infected P. monodon was performed. The RT-PCR was able to detect YHV 6 hrs post infection of the virus whereas the H&E staining method was able to confirm YHV histopathology at 48 hrs post infection.

Abstract: การเพาะเลี้ยงกุ้งในประเทศไทยได้ขยายตัวขึ้น อย่างรวดเร็วตั้งแต่ปี พ.ศ. 2528 เป็นต้นมา ปริมาณ การส่งออกในปี พ.ศ. 2537 มีมากถึง 248,000 เมตริกตัน และทำรายได้เข้าประเทศเป็นเงินถึงสองหมื่นห้าพันบ้านบาท แต่อย่างไรก็ตามความสำเร็จทางด้านการผลิตได้เพิ่มสูงขึ้น ไปพร้อม ๆ กับปัญหามลภาวะจากสภาพแวดล้อม การขาดการ จัดการที่ดี และโรคระบาด โดยเฉพาะอย่างยิ่งโรคระบาดที่ เกิดจากไวรัส ซึ่งในปัจจุบันมีไวรัส 2 ชนิดที่ได้ทำความ เสียหายให้กับอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยงกุ้งกุลาดำเป็น อย่างมาก ได้แก่ ไวรัสจุดขาว ไวรัสหัวเหลือง ในการศึกษา ครั้งนี้จึงมุ่งเน้นการพัฒนาการตรวจสอบที่ไวและจำเพาะต่อ การติดเชื้อจากไวรัสทั้งสอง ไวรัสจุดขาวถูกค้นพบโดยบังเอิญครั้งแรกในปี พ.ศ. 2537 ผลการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน พบว่า ไวรัสชนิดนี้อยู่ในรูป envelope มีลักษณะเหมือนแบคทีเรีย บาซิลไล มี fibril จำนวนมากยื่นออกมา ไวรัสชนิดนี้มีขนาด 276 x 121 นาโนเมตรและถูกจัดอยู่ในกลุ่ม baculovirus การศึกษาครั้งนี้ดีเอ็นเอของไวรัสจุดขาวได้ถูกนำมา เป็นตัวต้นแบบ ในปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ไพรเมอร์ถูกเลือกจากลำดับอนุรักษ์ของกรดอะมิโน polyhedrin gene จากไวรัสในกลุ่ม baculovirus ผลผลิต จากปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสมีขนาด 473 คู่เบส ต่อจากนั้น ได้นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอนี้ไปเชื่อมต่อกับพลาสมิดพาหะ pUC18 และโคลนเข้าสู่แบคทีเรีย E. coli DH5α โคลนลูกผสม หมายเลข 1 ได้ถูกคัดเลือกเพื่อทำการหาลำดับการเรียงตัว ของนิวคลีโอไทด์ เพื่อออกแบบไพรเมอร์ สำหรับขยายยีน ของไวรัสจุดขาวโดยเฉพาะ นอกจากนี้โคลนลูกผสมหมายเลข 1 ยังได้ถูกนำไปเป็นตัวตรวจสอบไวรัสจุดขาวโดยเทคนิค in situ hybridization อีกด้วย ผลการตรวจสอบ โดยวิธีนี้ พบว่า ตัวตรวจสอบที่ได้จากโคลนลูกผสมที่มี ชิ้นส่วนดีเอ็นเอขนาด 473 คู่เบส สามารถตรวจไวรัส จุดขาวได้อย่างจำเพาะโดยไม่ทำปฏิกิริยากับไวรัส MBV และไวรัสหัวเหลือง ผลผลิตจากการขยายยีนของไวรัส จุดขาวโดยอาศัยไพรเมอร์ที่ออกแบบจากลำดับการเรียงตัว ของนิวคลีโอไทด์ จากโคลนลูกผสมหมายเลข 1 พบว่าเกิด ผลผลิตขนาด 236 คู่เบสเฉพาะการขยายยีนของไวรัสจุดขาว เท่านั้น โดยไม่พบผลผลิตขนาดดังกล่าวจากไวรัสที่ก่อให้ เกิดโรคในกุ้งชนิดอื่นเลย นอกจากนี้ไพรเมอร์อีก 2 คู่ ได้ถูกนำมาใช้ร่วมกับไพรเมอร์คู่แรกเพื่อยืนยันผลของ ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสอีกด้วย การตรวจสอบไวรัสจุดขาว โดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสนี้พบว่ามีความไวและความ จำเพาะสูง กล่าวคือสามารถตรวจดีเอ็นเอของไวรัสจุดขาว ในระดับ 10 เฟมโตกรัม การขยายยีนได้ถูกนำมาใช้ในการ ตรวจกุ้งกุลาดำในภาคสนาม พบว่า การตรวจโดยใช้ไพรเมอร์ 1 คู่ ให้ผลสอดคล้องกับการตรวจโดยใช้ไพรเมอร์ 3 คู่ ไวรัสหัวเหลืองถูกค้นพบครั้งแรกในประเทศไทยในปี พ.ศ. 2535 ไวรัสชนิดนี้ทำให้เกิดความเสียหายแก่อุตสาหกรรม การเพาะเลี้ยงกุ้งถึงเจ็ดร้อยห้าสิบล้านบาท หลักฐานจาก การตรวจทางกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนและจากการเตรียมกรด นิวคลีอิค ชี้ให้เห็นว่าไวรัสหัวเหลืองเป็นอาร์เอ็นเอไวรัส อาร์เอ็นเอของไวรัสหัวเหลืองได้ถูกนำมาเป็นตัว ต้นแบบในปฏิกิริยาการเปลี่ยนอาร์เอ็นเอเป็นดีเอ็นเอคู่สม และปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส ไพรเมอร์ถูกออกแบบจากลำดับ อนุรักษ์ของกรดอะมิโน L(polymerase) protein gene จากไวรัสในกลุ่ม Rhabdoviruses ผลผลิตจากการขยายยีน มีขนาด 450 คู่เบส ต่อจากนั้นได้นำชิ้นส่วนดีเอ็นเอคู่สม นี้ไปเชื่อมต่อกับพลาสมิดพาหะ pUC18 และโคลนเข้าสู่ แบคทีเรีย E. coli DH5α โคลนลูกผสมหมายเลข 10 และ 20 ได้ถูกคัดเลือกเพื่อทำการหาลำดับการเรียงตัวของ นิวคลีโอไทด์ พบว่าโคลนลูกผสมทั้งสองมีลำดับการเรียงตัว ของนิวคลีโอไทด์จากโคลนลูกผสมหมายเลข 10 ผลผลิตที่ได้มี ขนาด 151 คู่เบส ซึ่งพบในการขยายยีนจากไวรัสหัวเหลือง เท่านั้นแต่ไม่พบในไวรัสที่ก่อให้เกิดโรคในกุ้งชนิดอื่น การตรวจไวรัสหัวเหลืองโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสนี้ พบว่ามีความไวและความจำเพาะสูงกล่าวคือสามารถตรวจ อาร์เอ็นเอของไวรัสหัวเหลืองในระดับ 5 เฟมโตกรัม การตรวจสอบโดยการใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสได้นำมา เปรียบเทียบกับวิธีตรวจสอบไวรัสหัวเหลืองด้วยวิธีย้อมสี H&E พบว่า ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสสามารถตรวจไวรัส หัวเหลืองได้ภายใน 6 ช.ม. หลังการติดเชื้อ แต่การย้อมสี H&E จะตรวจไวรัสพบได้เมื่อติดเชื้อไปแล้ว 48 ช.ม.

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Vichi Boonsaeng

Role: Thesis Advisors

Name: Anchalee Kamolnavin

Role: Thesis Advisors

Created: 1996

Modified: 2017-11-22

Issued: 2017-11-22

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	37880-eng.pdf	341.47 KB	12	2026-05-26 18:16:01
2	37880-tha.pdf	360.91 KB	13	2026-05-26 18:16:01
3	37880.pdf	34.18 MB	12	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

-0.552697 วินาที