Identification of thermotolerant bacteria producing cyclodextrin glycosyltransferase and enzyme characterization

การจำแนกแบคทีเรียทนร้อนที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสและลักษณะสมบัติของเอนไซม์

Name: Pornthida Yampayont

LCSH: Bacteria

LCSH: Cyclodextrins

Abstract: Thermotolerant bacteria producing cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) were screened from soil, water and starch waste from starch factory including samples contaminated with carbohydrates collected from various areas in Thailand. About ninety- seven colonies exhibited clear zone on Medium I agar plates containing soluble starch when with 0.02% I[subscript 2] in 0.2% KI in primary screening. Among them, three isolates (BT01, BD01 and BO01) exhibited CGTase activity by forming yellow clear zone on red background using Horikoshi medium plate phenolphthalene dyes system. These isolates were checked for growth and enzyme activity by culturing in Horikoshi broth at the temperature range of 37-50 ํC for selection of the best thermotolerant strain. It was found that BT01 grew and produced CGTase well at 37-45 ํC. Strain BT01 exhibited highest CGTase compared with BD01 and BO01. Therefore, BT01 was chosen for further optimized condition. Biochemical and physiological characterization showed that BT01 was Bacillus circulans and was further identified by 16S rRNA analysis was Paenibacillus sp. with 98% homology. BT01 grew and produced CGTase at temperature range 37-45 ํC. The optimum pH and temperature of starter inoculum for cell growth were pH 9.0 and 37 oC in Medium I. The optimum culturing conditions for highest CD-forming activity were pH 10.0 and 40 oC for 72 hours in Horikoshi broth containing 0.5% soluble starch. The enzyme was partially purified by starch adsorption, the recovery and purification fold were 65.1% and 28.0, respectively. The molecular weight was estimated to be 79 kDa by SDS-PAGE. The optimum temperature for dextrinizing and CD-forming activity were 70 and 50-55 ํC. At 55 and 70 ํC, the optimum pH for dextrinizing activity were 6.0, while CD-forming activity were 7.0. Dextrinizing activity of enzyme stabilized at temperature up to 30 ํC and at pH range 6.0-9.0, while CD-forming activity retained its full activity up to 70 ํๆC and at pH range 6.0-8.0 for 1 hour. In presence of CaCl2 and substrate the enzyme activity could be slightly stabilized. The best condition for storing enzyme was -20 ํC in presence of 10 mM CaCl2. Cyclodextrin products from CGTase of BT01 was a:b = 1:1. pH and temperature of reaction mixture can influence the rate of CDs production and the optimum temperature of starch conversion into CDs was 55-60 ํC. The source of starch is not important for CGTase action and the ratio of alpha:beta-CD was remained constant.

Abstract: จากการคัดเลือกแบคทีเรียทนร้อนที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรส (CGTase) จากแหล่งดิน น้ำ และของเสียจำพวกแป้งในโรงงานแป้งรวมทั้งตัวอย่างที่มีการปนเปื้อนของคาร์โบไฮเดรตซึ่งเก็บจากบริเวณต่างๆ ในประเทศไทย ในระดับปฐมภูมิพบแบคทีเรียจำนวน 97 โคโลนีที่ทำให้เกิดวงใสบนอาหารแข็ง Medium I ซึ่งมีแป้งเป็นส่วนประกอบเมื่อตรวจด้วย 0.02% I[subscript 2] ใน 0.2%KI ในจำนวนนี้พบว่ามี 3 ไอโซเลท (BT01, BD01 และ BO01) ที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสโดยทำให้เกิดวงใสสีเหลืองบนพื้นแดงบนอาหารแข็ง Horikoshi ซึ่งประกอบด้วยฟีนอฟทาลีน นำไอโซเลทเหล่านี้ไปเลี้ยงในอาหารเหลว Horikoshi เพื่อศึกษาการเจริญและการผลิตเอนไซม์ที่อุณหภูมิช่วง 37-50 องศาเซลเซียสและเลือกสายพันธุ์ที่มีลักษณะทนร้อนที่ดีที่สุด พบว่า BT01 เจริญและผลิตเอนไซม์ได้ดีในช่วง 37-45 องศาเซลเซียสและเป็นสายพันธุ์ที่ผลิตไซโคลเดกซ์ทรินไกลโคซิลทรานสเฟอเรสได้ดีที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับ BD01 และ BO01 ดังนั้นจึงเลือก BT01 ในการศึกษาหาภาวะที่เหมาะสมต่อไป จากการจำแนกสายพันธุ์ตามลักษณะทางชีวเคมีและสรีระวิทยาพบว่า BT01 คือ Bacillus circulans และจำแนกสายพันธุ์ด้วยวิธี 16S rRNA gene พบว่าเป็น Paenibacillus sp. โดยมีความคล้าย 98% BT01 เจริญและผลิตเอนไซม์ได้ดีที่อุณหภูมิ 37-45 องศาเซลเซียส pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการเลี้ยงเชื้อเพื่อใช้เป็นเชื้อตั้งต้นคือ pH 9.0 และ 37 องศาเซลเซียสในอาหารเหลว Medium I สภาวะที่เหมะสมในการผลิตเอนไซม์คือเลี้ยงในอาหาร Horikoshi ที่เติม soluble starch 0.5% pH ของอาหารเท่ากับ 9.0 เลี้ยงที่ 40 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 72 ชั่วโมง การทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์บางส่วนด้วยวิธีดูดซับด้วยแป้งได้เอนไซม์คงเหลือ 65% และความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 28 เท่า หาน้ำหนักโมเลกุลโดยวิธี SDS-PAGE มีค่าประมาณ 79 กิโลดาลตัน อุณหภูมิที่เหมาะสมในการวัด dextrinizing activity และ CD-forming activity คือ 70 และ 55 องศาเซลเซียสตามลำดับ ซึ่งทั้งอุณหภูมิ 55 และ 70 องศาเซลเซียสมี pH ที่เหมาะสมในการวัด dextrinizing activity และ CD-forming activity คือ pH 6.0 และ 7.0 ตามลำดับ วัด dextrinizing activity พบว่าเอนไซม์มีความเสถียรที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสและ pH 6.0-9.0 แต่เมื่อวัด CD-forming activity พบว่าเอนไซม์มีความเสถียรที่ 70 องศาเซลเซียสและ pH 6.0-8.0 เมื่อบ่มเอนไซม์ไว้ 1 ชั่วโมง การเติม CaCl[subscript 2] และ soluble starch มีผลต่อความเสถียรของเอนไซม์เล็กน้อย ผลิตภัณฑ์ไซโคลเดกซ์ทรินที่ได้มีอัตราส่วน alpha : beta-CD เท่ากับ 1:1 จากการศึกษาพบว่า pH และอุณหภูมิมีผลต่อการผลิตไซโคลเดกซ์ทริน และอุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการผลิตไซโคลเดกซ์ทริน คือ 55-60 องศาเซลเซียส พบว่าชนิดของแป้งไม่มีผลต่อการผลิตไซโคลเดกซ์ทรินซึ่งมีอัตราส่วนระหว่าง alpha : beta-CD คงที่

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Tipaporn Limpaseni

Role: advisor

Created: 2002

Modified: 2560-06-18

Issued: 2017-06-17

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9741729022

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/6453

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	porntida.pdf	17.26 MB	2	2025-12-17 09:16:43

ใช้เวลา

0.021609 วินาที