การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติทางชีวเคมีของไซลาเนสจากผลกล้วยน้ำว้า Musa sapientum

Purification and biochemical characterization of xylanse from namwa banana fruit Musa sapientum

Name: วนิดา พนายิ่งไพศาล

ThaSH: กล้วย

ThaSH: เอนไซม์

Abstract: ในการตรวจหาเอนไซม์ไซลาเนส (E.C.3.2.1.8) ในผลกล้วยน้ำว้าในแต่ละระยะของการสุกโดยวิธีการวัดความแน่นเนื้อ ตั้งแต่ในระยะที่เป็นผลดิบจนกระทั่งถึงระยะที่สุกเต็มที่พบว่าที่ความแน่นเนื้อ 210 cN สามารถสกัดไซลาเนสได้แอคติวิตีจำเพาะสูงสุดเท่ากับ 0.66 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน จึงได้ทำการสกัดแยกไซลาเนสอย่างหยาบจากผลกล้วยน้ำว้าที่ความแน่นเนื้อ 210 cN และทำให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนโปรตีนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟตอิ่มตัวที่ 80% จากนั้นผ่านคอลัมน์ซีเอ็ม-เซลลูโลสโครมาโตกราฟี และ คอลัมน์เซฟาเดกซ์จี-50 เจลฟิลเตรชันตามลำดับ ผลปรากฏว่าไซลาเนสที่ได้มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 14.7 เท่าและไม่พบแอคติวิตีของเซลลูเลส เมื่อตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม์ด้วยการทำเอสดีเอส-พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟริซิส จะพบแถบโปรตีนเพียง 1 แถบ มวลโมเลกุลที่หาได้จากการทำเอสดีเอส-พอลิอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟริซิสมีค่าเท่ากับ 19 กิโลดาลตัน ซึ่งได้ผลใกล้เคียงกับมวลโมเลกุลของไซลาเนสที่หาได้จากคอลัมน์เซฟาเดกซ์ จี-50 ซึ่งมีค่าเท่ากับ 21 กิโลดาลตัน ในการศึกษาสมบัติของเอนไซม์พบว่า ความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิ ที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์คือ 5.5 และ 45 องศาเซลเซียสตามลำดับ ความเสถียรของเอนไซม์ต่ออุณหภูมิอยู่ในช่วง 30 – 45 องศาเซลเซียส ค่า Km ของไซลาเนสต่อไซแลนจากเปลือกข้าวโอ๊ตและไม้เบิร์ชเท่ากับ 1.28 และ 0.50 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตรตามลำดับ ที่ความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์ของ Hg²⁺ และ Zn²⁺ เอนไซม์จะถูกยับยั้งการทำงานได้อย่างสมบูรณ์ ส่วน Cu²⁺ , Mg²⁺ , Sn²⁺ ,Fe²⁺ และ Ca²⁺ ที่มีความเข้มข้น 10 มิลลิโมลาร์จะสามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ 59.52 , 33.58 , 22.46 , 5.56 และ 2.60 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ ผลการดัดแปลงกรดอะมิโนของเอนไซม์ด้วยสารเคมีที่มีความจำเพาะพบว่า N-bromosuccinimide และ diethylpyrocarbonate ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์สามารถยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้ 96.4 และ 82.0 เปอร์เซ็นต์ตามลำดับ แสดงว่าทริปโตฟานและฮีสติดีนอาจจะเป็นกรดอะมิโนที่จำเป็นสำหรับการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์

Abstract: Xylanese (E.C.3.2.1.8) activity in Namwa banana pulp was measured at various stages of ripening determined as the texture hardness. The maximum specific activity of crude enzyme was found to be 0.66 unit/mg protein at the texture hardness of 210 cN , xylanase from this stage of ripening was purified. Purification of xylanase was achieved through the procedures of 80% saturated ammonium sulfate , CM-cellulose and Sephadex G-50 column chromatography. The purification was 14.7 fold and the enzyme showed no cellulose activity. The enzyme separated by SDS electrophoresis showed a single band . The molecular mass was 19 kDa as determined by SDS-PAGE which is close to the molecular mass of 21 kDa as determined by Sephadex G-50. The optimum pH and temperature for the action of the enzyme were at 5.5 and 45℃ respectively. Xylanase was stable at temperature 30-45 ℃. The enzyme reactions followed Michaselis-menten kinetics. The Lineweaver ̶ Burk plot showed Km values of 1.28 mg ml⁻¹ and 0.5 mg ml⁻¹ for the enzymatic hydrolysis of oat spelts xylan and birchwood xylan respectively. At 10 mM of the metal ion , Hg²⁺ and Zn²⁺ completely inhibited the enzyme activity. Cu²⁺ , Mg²⁺ , Sn²⁺ , Fe²⁺ and Ca²⁺ reduced the activity to 59.52 , 33.58 , 22.46 , 5.56 and 2.60 % respectively. The chemical modifying agents , N – bromosuccinimide (1.0 mM ) and diethyl pyrocarbonate (1.0 mM ) could reduce the xylabase activity to 96.4 and 82.0 % respectively. The results indicated that tryptophan and histidine residues may play an important role in the catalytical processes of the enzyme reaction.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: วิชัย สุทธิมูล

Role: ที่ปรึกษา

Name: ไพเราะ ปิ่นพานิชการ

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2546

Modified: 2560-05-27

Issued: 2560-03-18

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

ISBN: 9741754531

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: ชีวเคมี

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	Wanida_ph_front[1].pdf	2.97 MB	2	2020-01-28 18:32:58
2	Wanida_ph_ch1[1].pdf	3.7 MB	4	2019-09-13 14:30:56
3	Wanida_ph_ch2[1].pdf	3.9 MB	8	2020-10-11 12:27:28
4	Wanida_ph_ch3[1].pdf	4.59 MB	3	2020-10-11 12:28:10
5	Wanida_ph_ch4[1].pdf	2.08 MB	1	2018-06-09 01:35:15
6	Wanida_ph_ch5[1].pdf	687.49 KB	1	2018-06-09 01:35:16
7	Wanida_ph_back[1].pdf	4.17 MB	1	2018-06-09 01:35:16

ใช้เวลา

0.046262 วินาที