สารต้านจุลชีพที่ผลิตโดย Bacillus spp.

Antimicrobial substance produced by Bacillus spp.

Name: สุดารัตน์ บุญยง

ThaSH: แบคทีเรีย

ThaSH: บาซิลลัส

ThaSH: สารต้านจุลชีพ

Abstract: จากการคัดกรอง Bacillus spp. จำนวน 5 สายพันธุ์ ที่แยกได้จากดินในประเทศไทยซึ่งสามารถยับยั้ง จุลินทรีพย์ทดสอบด้วยวิธี cross streak พบว่า Bacillus sp. K-05 ยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวก แบคทีเรีย แกรมลบยีสต์และราเส้นใยได้ ศึกษาการสร้างสารด้านจุลชีพในอาหารเหลว NB TSB และ LB โดย วิธี paper disc diffusion พบว่าส่วนใสที่ได้จากการเลี้ยงเชื้อในอาหาร LB ยับยั้งจุลินทรีย์ทดสอบได้ ดีกว่า ส่วนใสที่ได้จากการเลี้ยงเชื้อในอาหาร NB และ TSB โดยพบว่าสามารถยับยั้งแบคทีเรีย แกรมบวก ได้แก่ Bacillus subtilis ATCC6633 Staphylococcus aureus ATCC25923 และ Micrococcus luteus แบคทีเรียแกรมลบ ได้แก่ Serratia sp. และราเส้นใยทั้ง 3 ชนิด ได้แก่ Aspergillus oryzae Fusarium sp. และ Alternaria sp. แต่ไม่พบการยับยั้งยีสต์ Saccharomyces cerevisiae และ Candida albicans สารต้านจุลชีพในส่วนใสซึ่งเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลานาน 10 เดือน มีฤทธิ์ยับยั้ง จุลินทรีย์ได้ แตกต่างกัน โดยพบว่าการยับยั้งจุลินทรีย์ทดสอบค่อย ๆ ลดลงตามระยะเวลา โดยมีการ ยับยั้งได้นาน ถึง 4-7 เดือน ขึ้นอยู่กับชนิดของจุลินทรีย์ทดสอบสารต้านจุลชีพทนต่อความร้อนระหว่าง 60-100 องศาเซลเซียส โดยมีผลยับยั้งจุลินทรีย์ทดสอบได้แตกต่างกัน เมื่อได้รับความร้อนที่ 121 องศาเซลเซียส พบว่าไม่มีฤทธิ์ยับยั้งจุลินทรีย์ทุกชนิดที่นำมาศึกษา การจำแนกสปีชีส์ของ Bacillus sp. K-05 โดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16S rDNA และเปรียบเทียบกับข้อมูลใน GenBank พบว่ามีความเหมือนกับ Bacillus subtilis M04 เท่ากับ 99% จึงจัดว่า Bacillus sp. K-05 เป็น Bacillus subtilis การสกัดแยกสารต้านจุลชีพด้วยตัวทำละลายอินทรีย์ พบว่าสารสกัดเอทิลอะซิเตทยับยั้ง จุลินทรีย์ทดสอบได้ดีกว่าสารสกัดเฮกเซนและสารสกัดเอทิลอีเทอร์ การแยกสารต้านจุลชีพโดย โครมาโทกราฟี แบบผิวบางด้วยระบบตัวพา คือ เมทานอล-เอทิลอะวิเตท (5:95) พบว่าแยกสารได้ 5 ตำแหน่ง มีค่า Rf เท่ากับ 0.21 0.33 0.43 0.55 และ 0.79 ผลการทำสารต้านจุลชีพให้บริสุทธิ์ด้วย คอลัมน์โครมาโทรกราฟี โดยมีระบบตัวพา คือ เฮกเซน-เอทิลอะซิเตท ได้สารที่บริสุทธิ์ 2 สาร มีลักษณะเป็นผงสีครีม ซึ่งมีฤทธิ์ยับยั้งแบคทีเรียแกรมบวก ได้แก่ B. subtilis ATCC6633 S. aureus ATCC25923 และ M. luteus จากการวิเคราะห์ โครงสร้างโดยวิธีทางเคมี สรุปได้ว่าสารที่ I คือ cyclo(Leu-Pro) มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 210.1446 สารที่ II คือ cyclo(Val-Pro) มีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 196.1269 ซึ่งยังไม่เคยมีรายงานมาก่อนว่ามีสาร cyclic dipeptide ดังกล่าวเป็นสารต้านจุลชีพที่ผลิต จาก B. subtilis

Abstract: Out of 5 strains of Bacilus spp. Isolated from soil in Thailand capable of inhibiting the test organism using cross streak method, Bacillus sp. K-05 showed antimicrobial activity against Gram positive and Gram negative bacteria, yeasts and molds. Antimicrobial substance production in NB, TSB and LB using paper disc diffusion as test method showed that the supernatant form culture broth of LB had higher antimicrobial activity than that of NB and TSB media. The supernatant had inhibitory activity against Gram positive bacteria i.e. Bacillus subtilis ATCC6633, Staphylococcus aureus ATCC25923, and Micrococcus luteus; Gram negative bacteria i.e. Serratia sp. and molds i.e. Aspergillus oryzae, Fusarium sp., Alternaria sp. but had no activity against yeasts i.e. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans. The antimicrobial substance in supernatant kept at 4 degrees Celsius for 10 months showed different inhibitory effect on the test organism. The acitivity gradually decreased as the keeping period increased whichshowed the inhibitory activity for 4-7 months depending on group of microorganism. The substance was stable after heat treatment at 60-100 degrees Celsius with different activity on test organisms but showed no activity after heated at 121 degrees Celsius Bacillus sp. K-05 was identified by nucleotide sequencing of 16S rDNA and compared with GenBank database. It was found that Bacillus sp. K-05 was 99% identity to Bacillus subtilis M04, thus it was identified as Bacillus subtilis. Extraction of substance by organic solvent showed that ethyl acetate extract had higher activity than that of hexane and ethyl ether extract. The ethyl acetate extract was analyzed by TLC using methanol-ethyl acetate (5:95) as solvent system. The mixture of antimicrobial substance were separated to 5 fractions with different Rf 0.21 0.33 0.45 0.55 and 0.79 After purification by column chromatography using hexane-ethyl acetate as eluted solvent, obtained fractions had 2 purified components which showed antimicrobial activity on B. subtilis ATCC6633, S. aureus ATCC25923, and M. luteus. Based on chemical analyses, the compound I and II were identified as cyclo(Leu-Pro) with M.W. 210.1446, and cyclo(Val-Pro) with M.W. 196.1269 respectively. This is the first report of cyclic dipeptide that exhibited antimicrobial activity produced by B. subtilis.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: ส่งศรี กุลปรีชา

Role: ที่ปรึกษา

Name: อมร เพชรสม

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2548

Modified: 2560-03-03

Issued: 2560-01-18

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/7255

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: จุลชีววิทยาทางอุตสาหกรรม

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	sudarat[1].pdf	7.24 MB	9	2024-09-18 15:49:33

ใช้เวลา

0.024668 วินาที