การพัฒนาเทคนิคระดับโมเลกุลเพื่อการจำแนกสายพันธุ์ Listeria innocua โดย High Resolution Melting Analysis

DEVELOPMENT OF MOLECULAR TECHNIQUE FOR Listeria innocua STRAINS DIFFERENTIATION BY HIGH RESOLUTION MELTING ANALYSIS

Name: กฤตาภรณ์ ถนัดสร้าง

ThaSH: ลิสทีเรีย -- การจำแนก

Abstract: Listeria innocua เป็น Listeria สปีชีส์ที่พบว่ามีการปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์ปรุงสุกและอาหารพร้อมบริโภคค่อนข้างมากจึงเป็นปัญหาในการส่งออกผลิตภัณฑ์ดังกล่าว แม้ว่าประเทศผู้นำเข้า เช่น สหรัฐอเมริกาและประเทศญี่ปุ่นจะกำหนดเกณฑ์มาตรฐานทางจุลินทรีย์เฉพาะ L. monocytogenes แต่เนื่องจากผู้นำเข้าในสหภาพยุโรปได้กำหนดไม่ให้พบ Listeria ทุกสปีชีส์ซึ่งรวมถึง L. innocua ดังนั้นจึงมีความจำเป็นต้องควบคุมไม่ให้มีการปนเปื้อน Listeria spp. ในผลิตภัณฑ์ มีงานวิจัยหลายฉบับรายงานว่า L. innocua มักจะปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมของกระบวนการผลิต ดังนั้นการศึกษาเส้นทางการปนเปื้อนของ L. innocua จากสิ่งแวดล้อมของกระบวนการผลิตสู่ผลิตภัณฑ์จึงเป็นสิ่งที่จำเป็นในการควบคุมและป้องกันการปนเปื้อนของ L. innocua เข้าสู่ผลิตภัณฑ์อาหาร ปัจจุบันมีงานวิจัยที่ใช้เทคนิคระดับโมเลกุลหลายวิธีในการตรวจติดตามแหล่งการปนเปื้อนของแบคทีเรียในอาหาร การวิเคราะห์ความแตกต่างที่บริเวณตำแหน่ง Tandem Repeat (TR) ภายในจีโนมของแบคทีเรียเป็นเทคนิคระดับโมเลกุลที่ใช้ในการจำแนกสายพันธุ์แบคทีเรียหลายชนิดและพบว่ามีความสามารถในการจำแนกสายพันธุ์สูงกว่าเทคนิคอื่นๆ แต่จำเป็นต้องใช้ Capillary Electrophoresis (CE) ซึ่งมีค่าใช้จ่ายสูงในการวิเคราะห์ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงได้พัฒนาเทคนิค High Resolution Melting Analysis (HRM) เพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างที่บริเวณตำแหน่ง TR ของ L. innocua เพื่อใช้ในการการจำแนกสายพันธุ์ L. innocua จำนวน 93 ไอโซเลทที่แยกได้จากผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมภายในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็งในโรงงานแห่งหนึ่ง ในขั้นแรกได้ใช้โปรแกรม Unipro UGENE ในการค้นหาตำแหน่ง TR ภายในจีโนมของ L. innocua และได้คัดเลือก TR 13 ตำแหน่งที่มีนิวคลีโอไทด์ซ้ำกันเป็นชุดอย่างน้อย 5 นิวคลีโอไทด์เพื่อใช้ในการวิเคราะห์ความแตกต่างด้วย CE และเทคนิค HRM จากนั้นออกแบบไพรเมอร์สำหรับเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอบริเวณตำแหน่ง TR ด้วยโปรแกรม Primer3 การพัฒนาเทคนิค HRM เริ่มจากการทดสอบการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ตำแหน่ง TR โดยได้เลือก L. innocua 11 ไอโซเลทจากแหล่งต่างๆกันภายในโรงงานผลิตไก่ปรุงสุกแช่เยือกแข็ง มาเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอที่ตำแหน่ง TR ทั้ง 13 ตำแหน่งด้วยไพรเมอร์ 13 คู่โดยปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส ตรวจสอบผลิตภัณฑ์ที่ได้จากปฏิกิริยาและวิเคราะห์ขนาดของชิ้นดีเอ็นเอโดย CE สำหรับตำแหน่ง TR ที่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้ จะนำมาวิเคราะห์ความเป็นไปได้ในการจำแนกความแตกต่างบริเวณตำแหน่ง TR ด้วยเทคนิค HRM พบว่า ไพรเมอร์ 8 คู่สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของทั้ง 11ไอโซเลทได้ที่ตำแหน่ง TR1, TR2, TR3, TR5, TR6, TR10, TR12 และ TR13 ซึ่งผลการวิเคราะห์ขนาดชิ้นดีเอ็นเอด้วย CE สอดคล้องกับผลการวิเคราะห์ด้วย HRM ในทุกตำแหน่ง ยกเว้นตำแหน่ง TR5 และ TR13 ที่มีการเปลี่ยนแปลงของนิวคลีโอไทด์บริเวณ TR ในบางไอโซเลท ซึ่ง CE ไม่สามารถจำแนกความแตกต่างของนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันได้ ในขณะที่เทคนิค HRM นั้นสามารถจำแนกได้โดยให้รูปแบบของ melting profile ที่แตกต่างกัน ในขั้นต่อมา จำแนกความแตกต่างของขนาดชิ้นดีเอ็นเอของ L. innocua ทั้ง 93 ไอโซเลทที่ตำแหน่ง TR ทั้ง 8 ตำแหน่งด้วย CE แล้ววิเคราะห์ความแตกต่างบริเวณ TR ด้วยเทคนิค HRM พบว่า ที่ตำแหน่ง TR1, TR3, TR6 และ TR13 มีความแตกต่างของขนาดชิ้นดีเอ็นเอและมีรูปแบบ melting profile จากการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค HRM เป็น 2, 6, 4, และ 6 รูปแบบที่ตำแหน่ง TR1, TR3, TR6 และ TR13 ตามลำดับ ในขณะที่ตำแหน่ง TR2, TR5, TR10 และ TR12 ไม่มีความแตกต่างของ TR ใน 93 ไอโซเลทที่ใช้ทดสอบ ซึ่งเทคนิค HRM สามารถจำแนกไอโซเลทที่มีขนาดชิ้นดีเอ็นเอแตกต่างกันออกจากกันและจัดกลุ่มไอโซเลทที่มีขนาดชิ้นดีเอ็นเอเท่ากันไว้ด้วยกันได้อย่างถูกต้องในทุกตำแหน่ง โดยมีข้อยกเว้นในไอโซเลทที่เกิดการเปลี่ยนแปลงของนิวคลีโอไทด์ในตำแหน่ง TR5 และ TR13 การประเมินความแม่นยำของเทคนิคโดยการทดสอบความสามารถในการวิเคราะห์ซ้ำ พบว่า เทคนิค HRM มีความสามารถในการวิเคราะห์ซ้ำภายในครั้งเดียวกันและวันที่ต่างกันในทุกตำแหน่ง การจำแนกสายพันธุ์ L. innocua โดยการวิเคราะห์ความแตกต่างบริเวณตำแหน่ง TR ด้วย CE และเทคนิค HRM สามารถจำแนก L. innocua 93 ไอโซเลทได้เป็น 10 จีโนไทป์และมีค่า Discriminatory index เป็น 0.45 โดยสามารถเชื่อมโยงสายพันธุ์ที่ปนเปื้อนในผลิตภัณฑ์และสิ่งแวดล้อมภายในบริเวณผลิตได้ สรุปได้ว่าเทคนิค HRM เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพในการจำแนกสายพันธุ์ L. innocua โดยการวิเคราะห์ความแตกต่างบริเวณ TR และสามารถใช้ทดแทนการวิเคราะห์ด้วย CE โดยให้ผลการวิเคราะห์ที่สอดคล้องกับ CE จึงเป็นเทคนิคที่สามารถนำไปใช้ติดตามสายพันธุ์ของ L. innocua ที่ปนเปื้อนในอุตสาหกรรมอาหารได้

Abstract: Listeria innocua is the most common specie found in ready-to-eat meat products which lead to rejection of food products. Especially, the foods imported to European countries require “Zero-Tolerance” for all species of Listeria, which is including L. innocua. Many researches worldwide have reported that L. innocua is the most frequently found species in food products and plant environments. Therefore, understanding the routes of contamination of L. innocua is necessary for controlling and preventing L. innocua contamination into food products. Currently, molecular subtyping techniques are frequently used for tracking sources of microbial contamination in food products. Variance detection of Tandem Repeat (TR) loci was a technique previously used for subtyping many microorganisms and showed higher discriminatory power than other techniques. However, this technique still needs Capillary Electrophoresis (CE) for detecting difference of amplicon size, which is relatively expensive. Therefore, in this study, High Resolution Melting Analysis (HRM) was developed for variant detection of Tandem Repeat loci for strain differentiation of L. innocua. Ninety-three isolates of L. innocua obtained from a cooked frozen chicken plant were used for experiment. Unipro UGENE program was used to locate TR loci within L. innocua genome and 13 TR loci (designated TR1-TR13) which had at least 5 nucleotides repeated were chosen. Primers for amplification of these TR loci were designed by Primer3. For primer validation, 11 isolates were selected from different locations in the processing plant and used to amplify TR region with 13 primers by Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplified products were separated and sized by Capillary Electrophoresis (CE). Feasibility of HRM technique to differentiate variances of TR was also demonstrated on the 11 isolates at the TR loci which were successfully amplified. The results showed that 8 primer sets were successfully amplified the 11 isolates at TR1, TR2, TR3, TR5, TR6, TR10, TR12 and TR13. The results of size analysis by CE were consistent with HRM melting profile at every locus, except TR5 and TR13 where the point mutation occurred within amplicon which could not be detected by CE but HRM could discriminate the amplified products of the same size with differing in nucleotide composition. Then, these 8 loci were used for size analysis of 93 isolates of L. innocua by CE followed by HRM analysis. Four TR loci (TR1, TR3, TR6 and TR13) were found discriminatory in size analysis. HRM analysis revealed 2, 6, 4 and 6 different types at TR1, TR3, TR6 and TR13, respectively, while no variation were detected at TR2, TR5, TR10 and TR12. The isolates with different sizes could be discriminate from each other by HRM and the isolates which had the same amplicon size were grouped together. Repeatability and reproducibility of HRM technique were also evaluated and the results showed that HRM technique was repeatable and reproducible. Subtyping of L. innocua by variance detection of TR loci using CE and HRM could discriminate 93 isolates into 10 genotypes with discriminatory index of 0.45. This technique could also infer relationship between strains contaminated in products and plant environments. In conclusion, detection of TR loci by HRM technique is a highly potential technique for subtyping of L. innocua which can be used to replace CE and can be applied for tracking sources of L. innocua contamination in food processing plants.

จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. สำนักงานวิทยทรัพยากร

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: สุวิมล กีรติพิบูล

Role: ที่ปรึกษา

Created: 2556

Modified: 2559-11-02

Issued: 2559-09-26

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42646

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เทคโนโลยีทางอาหาร

Grantor: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

©copyrights จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5471912823.pdf	7.24 MB	7	2022-09-01 15:15:30

ใช้เวลา

0.029036 วินาที