INFLUENCE OF FREEZING STAGES ON INFLUENZA VIRUS HAEMAGGLUTININ CONFORMATION DURING LYOPHILIZATION

อิทธิพลของขั้นตอนการทำเยือกแข็งต่อโครงรูปฮีมแอกกลูตินิน ของไวรัสไข้หวัดใหญ่ระหว่างการทำแห้งเยือกแข็ง

Name: Doan Thanh Phuong

Abstract: The purpose of this study was to evaluate the impact of freezing stages on influenza Haemagglutinin (HA) conformation and the influence of lyophilization cycle on properties of final lyophilized live attenuated influenza virus (LAIV) vaccine as well as their stabilities. Firstly, the effect of three freezing rates, rapid freezing (0.50oC/min), moderate freezing (1.08oC/min) and slow freezing (2.58oC/min) on HA conformational stability was investigated by far-UV, near-UV circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The three freezing rates resulted in the loss in secondary and tertiary structures when HA powder was prepared in aqueous solution. Therefore, suitable stabilizers were added in HA formulations for better preservation during freezing cycles. Four mannitol-based formulations were tested, G6S0, G6S1, G0S1 and G0S0, where G and S were glycine and sucrose and numerals expressed as concentrations (%w/v) of each stabilizer. G6S0 formulation exhibited the smallest effect in both secondary and tertiary structures of HA after frozen at moderate freezing rate (1.08oC/min) as compared to unstabilized HA. Consequently, the moderate freezing rate of 1.08oC/min was used as the freezing stage of the final lyophilization procedure applied on LAIV vaccine formulations. Initially, lyophilization procedure resulted in acceptable LAIV products when characterized on physical appearance, reconstitution time, pH, osmolality, thermal behavior, crystallinity and infectivity titer. Only residual moisture contents were greater than specified. The stability studies were carried out under three sets of conditions: 30oC/75%RH, -20oC and 2-8oC. All formulations displayed loss in infectivity titers during the first week of storage at 30oC/75%RH. Stability determination at 2-8oC showed that only G6S0 and G6S1 products were stable throughout the 6 months study period with excellent infectivity titers similar to products stored at -20oC. In summary, glycine plays an important role in stabilizing HA conformation as well as stability of lyophilized LAIV vaccine mannitol-based products. It should be used in the future development for the manufacturing of lyophilized LAIV vaccine products.

Abstract: วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้เพื่อศึกษาผลกระทบของขั้นตอนการทำเยือกแข็งต่อโครงรูปฮีแมกกลูตินิน ของไวรัสไข้หวัดใหญ่และอิทธิพลของวัฏจักรการทำแห้งเยือกแข็งต่อคุณสมบัติของวัคซีนไข้หวัดใหญ่ชนิดเชื้อเป็นจากการทำแห้งแบบเยือกแข็ง รวมถึงความคงตัวของวัคซีน ผลจากอัตราเร็วการทำเยือกแข็งสามระดับ ได้แก่ การทำเยือกแข็งความเร็วสูง (0.50 องศาเซลเซียสต่อนาที) การทำเยือกแข็งความเร็วปานกลาง (1.08 องศาเซลเซียสต่อนาที) และการทำเยือกแข็งความเร็วต่ำ (2.58 องศาเซลเซียสต่อนาที) ต่อความคงตัวของโครงรูปฮีแมกกลูตินิน โดยใช้เครื่องมือ ยูวีสเปกโทรสโกปีย่านไกล ยูวีสเปกโทรสโกปีย่านไกล้ เซอร์คิวลาร์ไดโครอิซึมสเปกโทรสโกปี และฟลูออเรสเซนต์สเปกโทรสโคปี จากการศึกษาพบว่าอัตราเร็วในการทำเยือกแข็งทั้งสามระดับมีผลให้โครงสร้าง ทุติยภูมิและตติยภูมิของสารละลายฮีแมกกลูตินินเสียหาย ดังนั้นจึงควรเพิ่มสารเพิ่มความคงตัวที่เหมาะสมในตำรับฮีแมกกลูตินินเพื่อรักษาสภาพระหว่างวัฏจักรการทำแห้งเยือกแข็งให้ดียิ่งขึ้น ตำรับที่มีแมนนิทอลเป็นองค์ประกอบหลักในการศึกษานี้มี 4 ตำรับ ได้แก่ G6S0, G6S1, G0S1 และ G0S0 เมื่อ G และ S คือ ไกลซีนและซูโครส และตัวเลขในสูตรแสดงถึงร้อยละโดยน้ำหนักของสารเพิ่มความคงตัวในสารละลาย จากการศึกษา ตำรับ G6S0 มีผลให้โครงสร้างทุติยภูมิและตติยภูมิของฮีแมกกลูตินินเปลี่ยนแปลงน้อยที่สุด ภายหลังจากการทำเยือกแข็งด้วยอัตราเร็วปานกลาง (1.08 องศาเซลเซียสต่อนาที) เมื่อเปรียบเทียบกับฮีแมกกลูตินินที่ไม่ได้ใส่สารเพิ่มความคงตัว ดังนั้นการทำเยือกแข็งอัตราเร็วปานกลาง (1.08 องศาเซลเซียสต่อนาที) จึงนำมาใช้ในกระบวนการการทำแห้งเยือกแข็งของสูตรตำรับวัคซีนไข้หวัดใหญ่ชนิดเชื้อเป็น พบว่ากระบวนการทำแห้งเยือกแข็งนี้ให้ผลิตภัณฑ์วัคซีนไข้หวัดใหญ่ชนิดเชื้อเป็นที่ยอมรับได้ โดยวิเคราะห์จากลักษณะทางกายภาพ เวลาในการละลายผงยาแห้ง ความเป็นกรดด่าง ค่าออสโมลาริตี คุณสมบัติทางความร้อน ความเป็นผลึก และค่าไตเตอร์ที่สามารถระงับการติดเชื้อไวรัส อย่างไรก็ตามมีเพียงความชื้นหลงเหลือเท่านั้นที่มีค่ามากกว่าเกณฑ์ที่กำหนด ทำการทดสอบความคงตัวภายใต้สามสภาวะได้แก่ สภาวะที่หนึ่ง อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส ความชื้นสัมพัทธ์ ร้อยละ 75 สภาวะที่สอง อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส และสภาวะที่สาม อุณหภูมิ 2-8 องศาเซลเซียส จากการทดสอบ พบว่าทุกตำรับสูญเสียค่าไตเตอร์ที่สามารถระงับการติดเชื้อไวรัสภายในสัปดาห์แรกของการเก็บตัวอย่างที่สภาวะที่หนึ่ง สำหรับภาวะที่สามพบว่าเฉพาะสูตร G6S0 และ G6S1 มีความคงตัวตลอดระยะเวลา 6 เดือน โดยมีค่าไตเตอร์ที่สามารถระงับการติดเชื้อไวรัสดีในระดับเดียวกันกับการเก็บตัวอย่างที่สภาวะที่สอง ดังนั้นโดยสรุป ไกลซีนเป็นสารเพิ่มความคงตัวที่สำคัญต่อการรักษาโครงรูปของฮีแมกกลูตินิน และความคงตัวของผลิตภัณฑ์วัคซีนไข้หวัดใหญ่ชนิดเชื้อเป็นที่ผ่านการทำแห้งเยือกแข็ง ดังนั้นจึงควรนำความรู้ไปพัฒนาต่อเนื่องในอนาคตเพื่อขยายขนาดการผลิตวัคซีนไข้หวัดใหญ่ชนิดเชื้อเป็นโดยการทำแห้งเยือกแข็งต่อไป

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Narueporn Sutanthavibul

Role: advisor

Name: Jittima Chatchawalsaisin

Role: advisor

Created: 2014

Modified: 2016-08-17

Issued: 2016-08-17

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/46252

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Pharmaceutical Technology

Grantor: Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5676357633.pdf	5.26 MB	4	2018-06-09 01:01:33

ใช้เวลา

0.027632 วินาที