Multilocus sequence analysis of genes in soybean rhizobia isolated from Nongkula Subdistrict, Phitsanulok province

การวิเคราะห์มัลติโลคัสซีเคว็นซ์ของยีนในไรโซเบียมถั่วเหลืองที่แยกจากตำบลหนองกุลา จังหวัดพิษณุโลก

Name: Yaowapa Punyathiti

LCSH: Rhizobium

LCSH: Soybean

Abstract: Soybean rhizobia are bacteria in soybean root nodules which are able to convert atmospheric nitrogen to ammonia for soybeans to assimilate for growth. At present, there has been an annual decline in soybean cultivation areas and Thailand imports approximately 85% of local soybean consumption resulting in a trade deficit and in an opportunity loss for sustainable maintenance of soil quality. The aims of this research were to identify slow-growing soybean rhizobia from root nodules of soybean cultivar Chiangmai 2 grown in a 15 x 24 sq.m. experimental plot in Nongkula subdistrict, Phitsanulok province. Methods included RAPD-PCR fingerprinting with either RPO1 or CRL-7 as the primer, grouping slow-growing bacterial isolates with identical RAPD-PCR fingerprints into the same strains, constructing dendrograms from RAPD-PCR fingerprints, and identification of 5 selected soybean rhizobia by Multilocus Sequence Analysis (MLSA) of 16S rDNA, dnaK, nifH, glnII and recA. Experimental results showed 116 slow-growing bacterial isolates were obtained. Identical RAPD-PCR fingerprints showed 116 slow-growing bacterial isolates were 43 strains. Authentication tests with soybean seeds (Glycine max cv. CM2, CM60, ST1, ST2, ST3, SJ4, SJ5 and Sri Samrong1) revealed all the 43 strains were soybean rhizobia. BLAST results of glnII revealed the 5 soybean rhizobial strains could be grouped into two groups with strains NKL09216, NKL09231, NKL09666 and NKL09693 were found to be Bradyrhizobium yuanmingense while strain NKL09273 was found to be B. elkanii. MLSA using glnII yielded the same results as obtained from the BLAST program while MLSA from dendrograms constructed from sequences of the remaining four genes and concatenated sequences of the 5 genes could not identify the 5 soybean rhizobial strains into different species. They were found to be related to Bradyrhizobium elkanii, B. japonicum, B. liaoningense, and B. yuanmingense.

Abstract: ไรโซเบียมถั่วเหลืองเป็นแบคทีเรียในปมรากถั่วเหลืองซึ่งเปลี่ยนไนโตรเจนจากอากาศ เป็นแอมโมเนียให้ถั่วเหลืองใช้ในการเจริญ ในปัจจุบันพื้นที่เพาะปลูกถั่วเหลืองในประเทศไทยลดลงทุกปีและประเทศไทยนำเข้าถั่วเหลืองประมาณ 85% ของถั่วเหลืองที่บริโภคในประเทศ ทำให้ขาดดุลการค้าและขาดการบำรุงดินอย่างยั่งยืน วัตถุประสงค์ของงานวิจัยเพื่อจำแนกชนิดไรโซเบียมถั่วเหลืองจาก ต.หนองกุลา จ. พิษณุโลก วิธีทดลองประกอบด้วย การใช้แบคทีเรียประเภทเพิ่มจำนวนช้าที่แยกจากปมรากถั่วเหลืองพันธุ์เชียงใหม่ 2 ที่ปลูกในแปลงทดลองขนาด 15 x 24 ตารางเมตร ใน ต. หนองกุลา จ. พิษณุโลก และหาลายพิมพ์ดีเอ็นเอโดยใช้ปฏิกิริยา RAPD-PCR โดยใช้ RPO1 หรือ CRL-7 เป็นไพร์เมอร์ การสร้างต้นไม้วิวัฒนาการหรือเดนโดรแกรมจากลายพิมพ์ดีเอ็นเอและการคัดเลือกไรโซเบียมถั่วเหลืองประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 5 สายพันธุ์ ได้แก่ NKL09216, NKL09231, NKL09273, NKL09666 และ NKL09693 เพื่อจำแนกชนิดไรโซเบียมถั่วเหลืองโดยการวิเคราะห์มัลติโลคัสซีเคว็นซ์ของยีน 16S rDNA, dnaK, nifH, glnII และ recA ผลการทดลองได้แบคทีเรียประเภทเพิ่มจำนวนช้าจำนวน 116 ไอโซเลต ผลการจัดไอโซเลตที่มีลายพิมพ์ดีเอ็นเอเหมือนกันเป็นสายพันธุ์เดียวกัน พบว่าได้แบคทีเรีย 43 สายพันธุ์ ซึ่งผลการทดสอบความสามารถในการสร้างปมที่รากถั่วเหลือง (Glycine max) พันธุ์ ชม2, ชม60, สท1, สท2, สท3, สจ4, สจ5 และ ศรีสำโรง1 พบว่าแบคทีเรียทั้ง 43 สายพันธุ์เป็นไรโซเบียมถั่วเหลือง ผลการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rDNA, glnII, และ nifH โดยใช้โปรแกรม BLAST พบว่า สามารถแบ่งไรโซเบียมถั่วเหลืองทั้ง 5 สายพันธุ์ออกเป็น 2 กลุ่มอย่างชัดเจน โดยกลุ่มแรกประกอบด้วยสายพันธุ์ NKL09216, NKL09231, NKL09666 และ NKL09693 ซึ่งอาจเป็น Bradyrhizobium yuanmingense ในขณะที่สายพันธุ์ NKL09273 เป็น B.elkanii ผลการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน recA โดยใช้โปรแกรม BLAST พบว่าทั้ง 5 สายพันธุ์อาจเป็น B. japonicum อย่างไรก็ตาม ผลการเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน dnaK ไม่สามารถจำแนกสายพันธุ์ของไรโซเบียมถั่วเหลืองทั้ง 5 สายพันธุ์ ผลการสร้างเดนโดรแกรมโดยใช้สายพันธุ์อ้างอิง 16-19 สายพันธุ์ พบว่า เฉพาะเดนโดรแกรมที่สร้างจากลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน glnII ให้ผลการจำแนกชนิดเช่นเดียวกับที่ใช้วิธีเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนแต่ละยีนโดยใช้โปรแกรม BLAST ส่วนผลการสร้างเดนโดรแกรมจากลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 16S rDNA, dnaK, nifH, recA และลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนทั้งห้ายีนซึ่งนำมาเรียงต่อกัน ไม่สามารถจำแนกชนิดของไรโซเบียมถั่วเหลืองทั้ง 5 สายพันธุ์ เพราะผลการทดลองพบว่าไรโซเบียมถั่วเหลืองทั้ง 5 สายพันธุ์มีความใกล้ชิดทางวิวัฒนาการกับ Bradyrhizobium elkanii, B. japonicum, B. liaoningense, และ B. yuanmingense.

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Kanjana Chansa-ngavej

Role: advisor

Created: 2013

Modified: 2016-08-26

Issued: 2016-08-07

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

Spatial: Phitsanulok

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Industrial Microbiology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	yaowapa_pu.pdf	32.49 MB	2	2018-06-08 22:08:07

ใช้เวลา

0.024213 วินาที