การตรวจหาซิงเกิลนิวคลีโอไทด์โพลีมอร์ฟิซึมของยีนในระบบภูมิคุ้มกันที่มี ความสัมพันธ์กับความต้านทานโรคสเตรปโตคอคโคซิสในปลานิล

Identification of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of Immune Genes Related to Streptococcosis Resistance in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus)

Name: อนงค์ นิ่มละมัย

keyword: ปลานิล โรค

Classification :.LCCS: SH167.N54 อ3ก 2556

; ปลานิล โรคสเตรปโตคอคโคซิส

; ซิงเกิลนิวคลีโอไทด์โพลีมอร์ฟิซึม

; ระบบภูมิคุ้มกัน

Abstract: การตรวจหาซิงเกิลนิวคลีโอไทด์โพลีมอร์ฟิซึม (สนิป) ของยีนในระบบภูมิคุ้มกันที่มีความสัมพันธ์กับความต้านทานโรคสเตรปโตคอคโคซิสในปลานิลเริ่มจากการทดสอบความรุนแรงของเชื้อ Streptococcus agalactiae โดยฉีดเชื้อเข้ากล้ามเนื้อปลานิล (Oreochromis niloticus) ขนาดน้้าหนักเฉลี่ย 8.56  4.37 กรัม พบว่าจ้านวนแบคทีเรีย 2.43 x 104 CFU/ml ท้าให้ประชากรปลานิลที่ใช้ในการทดสอบตายร้อยละ 50 (LD50) ในระยะเวลา 14 วัน หลังจากนั้นทดสอบการต้านทานโรค โดยฉีดเชื้อที่ระดับความเข้มข้น 2.43 x 104 CFU/ml ให้ปลาขนาดน้้าหนักเฉลี่ย 9.74  8.16 กรัม ที่ได้จากที่ต่างกันจ้านวน 7 แหล่ง ๆ ละ 100 ตัว สังเกตอาการของปลาทดลองเป็นเวลา 14 วัน พบว่า ปลานิลที่มาจากแหล่งต่างกันมีอัตรารอดต่างกันอย่างมีนัยส้าคัญทางสถิติ (P0.05) คือ ปลานิลจากฟาร์ม TF1, TF5, TF2, TF6, TF3, TF4, และ TF7 มีอัตรารอดเฉลี่ยเท่ากับ 82.80  0.38, 77.40  0.42, 76.00  0.43, 68.40  0.48, 61.00  0.49, 31.00  0.47 และ 16.80  0.38 เปอร์เซ็นต์ ตามล้าดับ จากนั้นจึงน้าตัวอย่างปลาที่ได้จากการทดลองไปตรวจหาสนิปของยีนในระบบภูมิคุ้มกันด้วยเทคนิค PCR-Single Strand Conformation Polymorphism (PCR - SSCP) ในกลุ่มปลานิลตัวอย่างที่มีอัตรารอดตายมากที่สุด (TF1) และน้อยที่สุด (TF7) ทั้งหมด 77 ตัว ท้าปฏิกิริยาพีซีอาร์กับไพรเมอร์จ้าเพาะของยีนในระบบภูมิคุ้มกัน พบผลผลิต PCR จ้านวน 11 ยีนคือ BPI/LBP, TCR, MHC class II, NOD1, transferrin, IgM heavy chain, CD8, TCR, IL8, granzyme และ hepcidine ที่มีขนาดคู่เบสเท่ากับ 121, 149, 207, 207, 209, 300, 395, 407, 408, 461 และ 473 ตามล้าดับ และเมื่อน้ามาตรวจสอบด้วยเทคนิค SSCP พบว่าทั้งในกลุ่มปลาตายและปลาที่รอดตาย มีรูปแบบดีเอ็นของยีน BPI/LBP, TCR, MHC class II, NOD1, transferrin, IgM heavy chain, CD8, TCR, IL8 และ hepcidine ที่ไม่มีความแตกต่างกัน แต่พบความแตกต่างในยีน granzyme และเมื่อน้ายีนนี้ไปวิเคราะห์สนิปด้วยวิธีการหาล้าดับเบส (DNA Sequencing) พบว่ามีล้าดับเบสตรงกับยีน Oreochromis niloticus granzyme (ที่เคยมีผู้ศึกษาไว้แล้ว) และพบสนิปเกิดขึ้นใน 6 ต้าแหน่ง ในล้าดับเบสที่ 87, 225, 264, 276, 425 และ 433 มีลักษณะของสนิปแบบ G>A, A>G, A>G, A>C, A>T และ A>G ตามล้าดับ โดยพบว่าสนิปในต้าแหน่งเบสที่ 425 และ 433 ของปลาที่ได้จากแหล่งที่มีอัตรารอดมากที่สุด (TF1) มีความสัมพันธ์กับความต้านทานโรคอย่างมีนัยส้าคัญทางสถิติ (P<0.05) ส่วนปลานิลจากแหล่งที่มีอัตรารอดน้อยที่สุด (TF7) มีเฉพาะสนิปในต้าแหน่งเบสที่ 433 ที่มีความสัมพันธ์กับความต้านทานโรคอย่างมีนัยส้าคัญทางสถิติ (P<0.05) ซึ่งสนิปทั้งสองต้าแหน่งดังกล่าวสามารถพัฒนาเป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอ ส้าหรับใช้ในการคัดเลือกปลานิลที่มีความต้านทานโรคสเตรปโตคอคโคซิสได้

Abstract: Identification of Single Nucleotide Polymorphism (SNP) related to streptococcosis resistance in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) was initially carried out by investigation degree of disease tolerance of fish and consequently identification of SNP was performed. Intramuscular injection of Streptococcus agalactiae was done in fish of 8.56  4.37 g fish when LD50 was obtained at 2.43 x 104 CFU/ml within 14 days post-injection. The bacteria at the concentration of 2.43 x 104 CFU/ml was then injected into the fish of an average weight of 9.74  8.16 g obtained from 7 different stations each of 100 fish. After 14 days post-injection the result showed that fish from different sources exhibited significantly different in degrees of survival rate (P0.05). The survival rates were observed at 82.80  0.38 %, 77.40  0.42 %, 76.00  0.43 %, 68.40  0.48 %, 61.00  0.49 %, 31.00  0.47 % and 16.80  0.38 % in fish from stations TF1, TF5, TF2, TF6, TF3, TF4 and TF7, respectively. The immune genes in both death and survived fish were then analyzed using PCR-Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) technique. A total of 77 fish from group of highest mortality rate (TF1) and lowest mortality rate (TF7) were used for PCR reaction using specific primers of the immune genes. The PCR products of 11 immune genes were observed including BPI / LBP, TCR, MHC class II, NOD1, transferrin, IgM heavy chain, CD8, TCR, IL8, granzyme and hepcidine with base pair sizes of 121, 148, 207, 207, 209, 300, 395, 407, 408, 461 and 473, respectively. Polymorphisms were then examined by nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis for SSCP analysis. It was found that amplicons from 10 gene-specific primers including BPI/LBP, TCR, MHC class II, NOD1, transferrin, IgM heavy chain, CD8, TCR, IL8 and hepcidine showed no difference in polymorphism. However, polymorphism was detected in granzyme in which DNA sequencing was 99% similar to Oreochromis niloticus granzyme. In this gene, SNP was found in 6 positions including 87, 225, 264, 276, 425 and 433, which substitute patterns of G>A, A>G, A>G, A>C, A>T and A>G, respectively. SNP at nucleotide position of 425 and 433 of fish in the group highest survival rate (TF1) found to significantly relate to disease resistant (P<0.05). While significant relation was only found in nucleotide position of 433 in fish of lowest survival rate (TF7). These SNPs are potentially developed as DNA marker for streptococcosis resistance in Nile tilapia.

WALAILAK UNIVERSITY. CENTER FOR LIBRARY RESOURCES AND EDUCATIONAL MEDIA

Address: NAKON SI THAMMARAT

Email: clm@wu.ac.th

Name: ปิยะพงค์ โชติพันธุ์

Role: ประธานกรรมการที่ปรึกษา

Created: 2559

Modified: 2559-07-05

Issued: 2559-07-05

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: SH167.N54 อ3ก 2556

tha

DegreeName: Master of Science (Agricultural Science)

Level: Master's Degree

Descipline: Agricultural Science

Grantor: Walailak University

©copyrights มหาวิทยาลัยวลัยลักษณ์

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	ปก.pdf	81.73 KB	8	2020-06-22 13:46:13
2	abstract.pdf	104.37 KB	4	2020-06-22 13:47:03
3	บทคัดย่อ.pdf	130.95 KB	8	2020-06-22 13:47:36
4	บทที่ 1 บทนำ วัตถุประสงค์.pdf	89.06 KB	6	2020-06-22 13:49:36
5	บทที่ 2 ทบทวนวรรณกรรม.pdf	429.05 KB	5	2018-09-17 09:39:57
6	บทที่ 3 วิธีการวิจัย.pdf	392.25 KB	13	2024-03-06 09:09:31
7	บทที่ 4 ผลการทดลอง.pdf	1 MB	7	2020-06-22 12:41:26
8	บทที่ 5 อภิปรายผลการทดลอง.pdf	303.81 KB	4	2018-06-08 10:39:56
9	บทที่ 6 สรุป.pdf	165.35 KB	4	2018-06-08 10:39:57
10	บรรณานุกรม.pdf	361.88 KB	5	2019-05-01 11:55:04
11	ภาคผนวก.pdf	1.63 MB	4	2018-06-08 10:39:59
12	สันปก.pdf	43.75 KB	2	2018-06-08 10:40:00

ใช้เวลา

0.043424 วินาที