Detection of exon-11 mutation in c-kit using PCR technique from canine cutaneous mast cell tumors obtained by fine-needle aspiration method

ตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ในยีน c-kit ด้วยเทคนิคพีซีอาร์จากเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ที่ผิวหนังของสุนัขที่เก็บโดยวิธีการเจาะดูด

Name: Dettachai Ketpun

LCSH: Dogs

LCSH: Tumors in animals

LCSH: Animal mutation

Abstract: This research has been objectively set up to study the usage of MCT cells collected by fine-needle aspiration (FNA) method for investigating mutant exon-11 in proto-oncogene c-kit from 30 MCT dogs. All studied MCT dogs were performed tissue biospsy for MCT histopathologic diagnosis and grading using Patniak histopathologic grading system. All biopsied tissues were also studied the staining patterns of KIT (CD117) by CD117-immunohistochemitry. The result was used as the standard criteria for CD117-immunocytochemistry interpretation. For fine-needle aspirated MCT cells (FNA-MCT cells) in cell suspensions, they were used further for study in detection of mutant exon-11 in c-kit. From flow cytometric quantitative analysis in fifteen FNA-MCT cell suspensions, the result suggested that there were approximately 6,345 FNA-MCT cells in 1 μl of cell suspensions (6.345 x 10⁶ cells/ ml). FNA-MCT cells were used for 2 purposes; the first for CD117-immunocytochemistry study and the last for DNA extraction used in PCR study. The result from CD117-immunocytochemistry indicated that the staining patterns of KIT mimic to the staining patterns observed in CD117-immunohistochemistry consisting of perimembrane, paranuclear and cytoplasmic diffuse. Moreover, the consequence also indicated that each specimen possessed the same staining pattern both in CD117-immunocytochemistry and CD117-immunohistochemistry except in one specimen having the different result. This suggested that FNA-MCT cells should be the representative of neoplastic cells in biopsied tissues. For PCR analysis, one FNA-MCT specimen classified as MCT-grade II by histopathology gave the positive outcome by detecting the mutant exon-11 in c-kit with PCR. In the comparative study of PCR analysis for mutant exon-11 in c-kit from FNA-MCT cells collected directly from the tumor mass with FNA-MCT cells sorted through flow cytometric cell sorter in one case, the results were not different from each other indicating that FNA-MCT cells directly obtained from the tumor mass should be the representative of MCT-cell populations in the biopsied tissue. In addition, they could be preliminarily applied for clinical detection of mutant exon-11 in c-kit by PCR. However, a mass study for further investigating the consistency of this method should be executed before this method will be clinically applied for MCT diagnosis and therapeutic planning.

Abstract: งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ที่อยู่ในโปรโตอองโคยีน c-kit ด้วยวิธีพีซีอาร์ จากเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ของสุนัขที่เก็บโดยวิธีการเจาะดูดเซลล์ในสุนัขที่เป็นเนื้องอกมาสต์เซลล์ที่ผิวหนังจำนวน 30 ตัวอย่าง สุนัขที่นำมาศึกษาทั้งหมดจะถูกเก็บตัวอย่างชิ้นเนื้อเพื่อวินิจฉัยและแบ่งเกรดของเนื้องอกมาสต์เซลล์ทางจุลพยาธิวิทยาโดยใช้ระบบการแบ่งเกรดเนื้องอกมาสต์เซลล์ทางจุลพยาธิวิทยาของ Patniak เป็นมาตรฐาน และตัวอย่างชิ้นเนื้อของสุนัขแต่ละตัวอย่างที่เก็บมาได้ยังนำมาศึกษารูปแบบการติดสีของโปรตีน KIT (CD117) ด้วยวิธีทางอิมมูโนฮีสโตเคมีด้วยเพื่อใช้เป็นเกณฑ์มาตรฐานสำหรับวิเคราะห์ผลการย้อมสีโปรตีน KIT ด้วยวิธีอิมมูโนไซโตเคมี และเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ที่เก็บได้ด้วยวิธีการเจาะดูดนั้นจะนำมาทำให้อยู่ในรูปสารแขวนลอยของเซลล์ เพื่อใช้สำหรับตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ที่อยู่ในโปรโตอองโคยีน c-kit ต่อไป จากการใช้เทคนิคโฟว์ไซโตเมตรี้ในการวิเคราะห์หาปริมาณของเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ของสุนัขในสารแขวนลอยของเซลล์จำนวน 15 ตัวอย่างก่อนทำพีซีอาร์พบว่า ในสารแขวนลอยของเซลล์เนื้องอก 1 ไมโครลิตรนั้นจะมีจำนวนของเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ที่เก็บโดยการเจาะดูดในสารแขวนตะกอนของเซลล์เฉลี่ยอยู่ที่ 6,345 เซลล์ (6.345 x 10⁶ เซลล์ต่อมิลลิลิตร) เซลล์เนื้องอกที่ได้จากการเจาะดูดนี้ส่วนหนึ่งจะนำมาย้อมสีโปรตีน KIT ด้วยวิธีทางอิมมูโนไซโตเคมีเพื่อศึกษารูปแบบการติดสีของโปรตีน KIT และอีกส่วนหนึ่งจะนำมาสกัดแยกสารพันธุกรรมเพื่อใช้ในการทำพีซีอาร์ต่อไป ผลของการศึกษาชี้ให้เห็นว่า รูปแบบการติดสีของโปรตีน KIT ที่ย้อมด้วยวิธีทางอิมมูโนไซโตเคมีนั้นจะมีรูปแบบที่เหมือนกันกับที่พบในเนื้อเยื่อตัวอย่างของเนื้องอกมาสต์เซลล์ที่ย้อมสีโปรตีน KIT ด้วยวิธีทางอิมมูโนฮีสโตเคมี โดยรูปแบบการติดสีมี 3 แบบคือ ติดสีรอบเยื่อหุ้มเซลล์ ติดสีรวมกลุ่มกันในไซโตปลาสมใกล้นิวเคลียสของเซลล์เนื้องอก หรือติดสีกระจายอยู่ทั่วไซโตปลาสมของเซลล์เนื้องอก ผลการศึกษายังแสดงให้เห็นว่าในตัวอย่างแต่ละราย จะมีรูปแบบการติดสีของโปรตีน KIT ที่เหมือนกันทั้งในเซลล์เนื้องอกที่ได้จากการเจาะดูด และในเนื้อเยื่อ โดยมีเพียงตัวอย่างเดียวที่ให้ผลการติดสีที่แตกต่างกัน ชี้ให้เห็นว่าเซลล์เนื้องอกที่ได้จากการเจาะดูดน่าจะเป็นตัวแทนที่ดีของเซลล์เนื้องอกที่อยู่ในเนื้อเยื่อ ในส่วนของการทำพีซีอาร์เพื่อตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ที่อยู่ในโปรโตอองโคยีน c-kit นั้นพบว่า ตัวอย่างของเซลล์เนื้องอกที่ได้จากการเจาะดูดจำนวน 1 ตัวอย่างซึ่งเป็นเนื้องอกมาสต์เซลล์เกรด 2 นั้นให้ผลเชิงบวก โดยตรวจพบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ที่อยู่ในโปรโตอองโคยีน c-kit ในตัวอย่างดังกล่าว ในขณะที่ตัวอย่างที่เหลือตรวจไม่พบการกลายพันธุ์ รวมทั้งผลการศึกษาเปรียบเทียบในการทำพีซีอาร์จากตัวอย่างของเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ที่เก็บได้โดยตรงจากก้อนเนื้องอกด้วยการเจาะดูดเซลล์ กับเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ที่ย้อมติดสีของโปรตีน KIT และถูกคัดกรองออกมาจากเครื่องโฟว์ไซโตมีเตอร์จากสุนัขตัวอย่างจำนวน 1 ราย ผลการศึกษาแสดงให้เห็นว่าผลพีซีอาร์ของเซลล์เนื้องอกจากทั้ง 2 แหล่งไม่มีความแตกต่างกัน ดังนั้นชี้ให้เห็นว่าเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ที่เก็บได้โดยตรงจากก้อนเนื้องอกนั้นสามารถใช้เป็นตัวแทนของเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ในก้อนเนื้องอก และสามารถนำมาใช้ในการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ในโปรโตอองโคยีน c-kit ได้ ดังนั้นจึงสรุปได้ว่าเซลล์เนื้องอกมาสต์เซลล์ของสุนัขที่เก็บได้โดยวิธีการเจาะดูดนั้นสามารถนำมาใช้ในการตรวจสอบการกลายพันธุ์ของเอ็กซอน 11 ในโปรโตอองโคยีน c-kit เบื้องต้นในทางคลินิกได้ แต่ความแม่นยำของวิธีการรวมทั้งการนำไปประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัย และวางแผนรักษาเนื้องอกมาสต์เซลล์ในระดับคลินิกนั้นยังคงต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมและควรจะมีการวางแผนขั้นตอนในการศึกษาให้รัดกุมต่อไป และควรจะศึกษาในตัวอย่างที่มีจำนวนมากขึ้นเพื่อให้ได้ผลที่แน่นอน ก่อนที่จะนำวิธีดังกล่าวไปประยุกต์ใช้ต่อไป

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Achariya Sailasuta

Role: advisor

Name: Prapruddee Piyawiriyakul

Role: advisor

Created: 2011

Modified: 2016-06-13

Issued: 2016-06-13

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/21714

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Pathobiology

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	dettachai_ke.pdf	2.52 MB	5	2021-10-09 23:36:11

ใช้เวลา

0.033459 วินาที