GLUTAMATE UPTAKE AND CHARACTERIZATION OF GLUTAMATE TRANSPORTER IN HALOTOLERANT CYANOBACTERIUM Aphanothece halophytica

การนำเข้ากลูตาเมตและลักษณะสมบัติของตัวขนส่งกลูตาเมตในไซยาโนแบคทีเรียทนเค็ม Aphanothece halophytica

Name: Bongkoj Boonburapong

LCSH: Glutamates

LCSH: Cyanobacteria

Abstract: Halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytica grown under various NaCl concentrations from 0.2 – 3.0 M showed the optimum NaCl concentration for growth at 0.5 M NaCl. The salt stress condition that decreased growth to half of maximum growth rate was 2.0 M NaCl. The growth inhibitory effect from salt stress condition was eliminated when 50 mM glutamate was present in the medium. These results indicated that exogenous glutamate was taken up by A. halophytica cells and enhanced growth of A. halophytica. Glutamate uptake of A. halophytica in the assay medium containing 0.5 M NaCl and 2.0 M NaCl exhibited the typical of Michaelis-Menten saturation kinetics with an apparent Michaelis constant value of 11.76 and 9.91 μM, respectively, and maximum velocity of 6.67 and 5.20 nmol.min-1.mg-1 protein, respectively. Glutamate uptake was strongly inhibited by inhibitors of dissipating ion gradients and slightly inhibited by various metabolic inhibitors and protonophores. Results of uptake experiment suggested that there are at least 2 glutamate transport system in A. halophytica, energy-dependent and sodium ion-stimulated. Based on the shot gun sequencing, A. halophytica contained a sodium dependent glutamate transporter (ApGltS) consisted of 476 deduced amino acid residues with a 51 kDa calculated molecular weight of 11 transmembrane segments. The deduced amino acid sequence of ApGltS exhibits low homology to GltS from Synechocystis sp. PCC 6803 and Escherichia coli but highly conserved especially in the putative pore-loop regions. The ApgltS gene was isolated and expressed in glutamate transporter deficient E. coli ME9107. ApGltS expressing ME9107 took up glutamate and its rates increased with the increasing NaCl concentrations. Kinetics studies revealed that ApGltS is a high affinity glutamate transporter with a Michaelis constant value of about 5 µM. The presence of 0.5 M NaCl in the assay medium increased the maximum velocity by 3-fold. Competition experiments indicated that glutamate, glutamine, aspartate and asparagine inhibited glutamate uptake. ApGltS was expressed under its own promoter in Synechococcus sp. PCC 7942. Similar kinetic properties of ApGltS expressing ME9107, the maximum velocity values of Synechococcus sp. PCC 7942 expressing ApGltS slightly increased upon the increase of NaCl concentrations. Moreover, the glutamate uptake activity in natD-deficient Synechococcus sp. PCC 7942 expressing ApGltS was significantly increased comparing with control vector transformants. These results indicated that A. halophytica has sodium dependent glutamate symporter. We found that glutamate is major intracellular amino acid in A. halophytica. Content of intracellular glutamate in A. halophytica was increased 2-fold in mid-log phase cells grown under salt stress condition. The results showed that in A. halophytica, glutamate can be used as metabolic fuel and as precursor of other compounds such as gamma-aminobutyric acid (GABA), glycine, arginine, valine, leucine and also glycine betaine. Glycine betaine and GABA accumulation in mid-log phase cells grown under salt stress condition were increased about 2.8 and 2 folds, respectively comparing with normal growth condition. The glycine betaine and GABA content were increased maximally about 4.8 and 2.2 folds when mid-log phase cells were grown under salt stress condition and adapted in the medium contained 2.0 M NaCl supplemented with 5 mM glutamate for 4 hours. Under normal growth condition, A. halophytica accumulated about 2-4 fold higher GABA content than other tested cyanobacterial strains excepted for Arthrospira platensis

Abstract: ไซยาโนแบคทีเรียชนิดทนเค็ม Aphanothece halophytica สามารถเจริญภายใต้ภาวะที่มีความเครียดจากเกลือโซเดียมคลอไรด์ตั้งแต่ 0.2 – 3.0 โมลาร์ โดยเกลือโซเดียมคลอไรด์ 0.5 โมลาร์เป็นความเข้มข้นที่เหมาะสมต่อการเจริญ (ภาวะปกติ) สำหรับภาวะเครียดจากเกลือที่ทำให้อัตราการเจริญลดลงเป็นครึ่งหนึ่งของสภาวะปกติ คือที่ความเข้มข้น 2.0 โมลาร์ อัตราการเจริญที่ลดลงที่เป็นผลจากภาวะเครียดจากเกลือหมดไปเมื่อมีการเติมกลูตาเมต 50 มิลลิ โมลาร์ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยผลการทดลองดังกล่าวชี้ชัดว่ากลูตาเมตที่อยู่ภายนอกเซลล์ถูกขนส่งเข้าสู่เซลล์และทำให้การเจริญเติบโตของ A. halophytica สูงขึ้น การนำเข้ากลูตาเมตของ A. halophytica ในภาวะที่มีเกลือโซเดียม คลอไรด์ 0.5 และ 2.0 โมลาร์แสดงอิ่มตัวด้วยค่าคงที่มิเคลลิส เมนเทนเท่ากับ 11.76 และ 9.91 ไมโครโมลาร์ และมีค่าความเร็วสูงสุดเท่ากับ 6.67 และ 5.20 นาโนโมลต่อนาทีต่อมิลลิกรัมโปรตีน ตามลำดับ การนำเข้ากรดอะมิโนกลูตาเมตลดลงอย่างมากเมื่อมีการใช้ตัวยับยั้งที่ทำลายเกรเดียนต์ของไอออน และยังถูกยับยั้งการนำเข้าด้วยตัวยับยั้งกระบวนการเมตาบอลิซึม และโปรโตโนฟอร์อีกด้วย จากผลการทดลองข้างต้นทำให้ทราบว่าตัวขนส่งกลูตาเมตใน A. halophytica มีอย่างน้อย 2 ระบบ คือ ตัวขนส่งกลูตาเมตแบบที่ต้องใช้พลังงาน และตัวขนส่งกลูตาเมตแบบที่ต้องใช้โซเดียมอิออนในการนำเข้ากลูตาเมต และจากข้อมูลจากการทำ shot gun sequencing พบว่าใน A. halophytica มีตัวขนส่งกลูตาเมตแบบที่ต้องใช้โซเดียมอิออน (ApGltS) ซึ่งประกอบด้วยกรดอะมิโน 476 เรซิดิว มีมวลโมเลกุลจากการคำนวณเท่ากับ 51 กิโลดาลตัน ประกอบด้วย 11 ทรานส์เมมเบรน โดยลำดับกรดอะมิโนของ ApGltS มีความคล้ายคลึงต่ำเมื่อเปรียบเทียบกับ GltS ของ Synechocystis sp. strain PCC 6803 และ Escherichia coli แต่มีความคล้ายคลึงสูงในบริเวณอนุรักษ์ที่อยู่ภายในส่วน pore-loop regions โดยยีน ApgltS ถูกนำมาโคลนและศึกษาลักษณะสมบัติใน E. coli ME9107 ที่ไม่มีตัวขนส่งกลูตาเมต โดยพบว่า ME9107 ที่มีการแสดงออกของ ApGltS สามารถนำเข้ากลูตาเมต และอัตราการนำเข้ากลูตาเมตเพิ่มขึ้น เมื่อความเข้มขันของเกลือโซเดียมคลอไรด์เพิ่มขึ้น ผลการศึกษาจลนพลศาสตร์พบว่า ApGltS เป็นตัวขนส่งกลูตาเมตที่มีความสามารถในการจับสูงด้วยค่าคงที่มิเคลลิส เมนเทนประมาณ 5 ไมโครโมลาร์ และค่าความเร็วสูงสุด เพิ่มขึ้นประมาณ 3 เท่าเมื่อใน assay medium มีเกลือโซเดียมคลอไรด์ 0.5 โมลาร์ การนำเข้ากรดอะมิโนกลูตาเมตถูกยับยั้งด้วยกรดอะมิโนกลูตาเมต กลูตามีน แอสพาเตท และแอสพาราจีน นอกจากนี้ยีน ApgltS ถูกนำมาใส่เข้าไปใน Synechococcus sp. PCC 7942 และแสดงออกภายใต้โปรโมเตอร์ของยีน ApgltS โดยผลการศึกษาจลนพลศาสตร์มีความคล้ายคลึงกับใน ME9107 คือ ค่าความเร็วสูงสุดของ Synechococcus sp. PCC 7942 ที่มีการแสดงออกของ ApGltS เพิ่มขึ้นเมื่อความเข้มขันของเกลือโซเดียมคลอไรด์เพิ่มขึ้น นอกจากนี้ Synechococcus sp. PCC 7942 ที่มีการกลายพันธุ์ที่ยีน natD ที่มีการแสดงออกของ ApGltS มีแอคติวิตี้ในการขนส่งกลูตาเมตเพิ่มขึ้นอย่างชัดเจนเมื่อเปรียบเทียบกับทรานส์ฟอร์มแมนต์ที่มี control vector ผลการทดลองเหล่านี้บ่งชี้ว่า A. halophytica มีตัวขนส่งกลูตาเมตแบบต้องใช้โซเดียมอิออน และพบว่ากลูตาเมตเป็นกรดอะมิโนภายในเซลล์หลักใน A. halophytica โดยปริมาณกลูตาเมตภายในเซลล์ของ A. halophytica ที่เจริญภายใต้ภาวะเครียดจากเกลือในช่วง mid-log จะเพิ่มขึ้น 2 เท่า โดยกลูตาเมตสามารถถูกใช้เป็นแหล่งพลังงานและสารตั้งต้นสำหรับสารอื่นๆ เช่น กาบา ไกลซีน อาร์จีนีน วาลีน ลิวซีน และไกลซีน บีเทน โดยพบว่าปริมาณไกลซีน บีเทน และกาบาภายในเซลล์ของ A. halophytica ที่เจริญภายใต้ภาวะเครียดจากเกลือในช่วง mid-log จะเพิ่มขึ้น 2.8 และ 2 เท่า ตามลำดับเมื่อเทียบกับภาวะปกติ โดยปริมาณไกลซีน บีเทน และกาบาภายในเซลล์จะเพิ่มสูงสุด 4.8 และ 2.2 เท่า ตามลำดับ เมื่อใช้เซลล์ในช่วง mid-log ที่เลี้ยงในภาวะปกติ มาย้ายลงอาหารใหม่ที่มีเกลือโซเดียมคลอไรด์ 2.0 โมลาร์และมีการเติมกลูตาเมต 5 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 4 ชั่วโมง เมื่อเทียบกับภาวะควบคุม ภายใต้ภาวะเจริญปกติ A. halophytica มีความสามารถในการสะสมกาบาสูงกว่าไซยาโนแบคทีเรียสายพันธุ์อื่นๆที่ทำการทดสอบประมาณ 2 – 4 เท่า ยกเว้น Arthrospira platensis

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Aran Incharoensakdi

Role: advisor

Name: Teruhiro Takabe

Role: advisor

Created: 2013

Modified: 2016-01-06

Issued: 2016-01-06

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

URL: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/42556*#

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5173828923.pdf	8.56 MB	11	2019-11-27 14:58:07

ใช้เวลา

0.035458 วินาที