Gene expression analysis and anti-WSSV property of antimicrobial peptides from the black tiger shrimp Penaeus monodon

การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนและสมบัติการต้านไวรัสจุดขาวของเพปไทด์ต้านจุลชีพจากกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon

Name: Noppawan Woramongkolchai

LCSH: Gene expression

LCSH: Peptide antibiotics

LCSH: Penaeus monodon

Abstract: Antimicrobial peptides of AMPs are small peptides which play an important role in the innate immune system by defending against invading microorganisms. The crustin, lysozyme, antilipopolysaccharide factor (ALF), and penaeidin (PEN) are AMPs identified from the Penaeus monodon EST database (http://www.pmonodon.biotec.or.th). Analysis of the P. monodon AMP transcripts by semi-quantitative RT-PCR revealed that the expression of ALF Pm3, ALF Pm6 and PenmonPEN5 was significantly increased after shrimp were challenged with white spot syndrome virus (WSSV). In this study, we further characterized PenmonPen5 for its role in anti-WSSV. Genomic organization of the PenmonPEN5 gene determined by PCR and genome walking revealed two exons interrupted by an intron, while the 5' upstream sequence contained a putative promoter, TATA box, and regulatory sequences, three GATA, and two each of GATA-3, activator protein 1 (AP-1) and dorsal transcription factor binding. These cis-regulatory elements are reported to be involved in the transcription of several arthropods antimicrobial peptide genes. The PenmonPen5 mRNA was mainly expressed in shrimp hemocytes and was up-regulated about 1.8 fold at 24h after challenge with WSSV as detected by quantitative real-time RT-PCR. The suppression of PenmonPen5 transcript levels by RNA interference mediated gene silencing led to an increase of WSSV copy number about 1.9 fold. The recombinant PenmonPen5 protein (rPenmonPEN5) over-expressed in the yeast Pichia pastoris exhibited antibacterial activity against Gram-positive bacteria, Micrococcus luteus and Aerococcus viridans. Incubation of the P. monodon hemocyte primary cell culture with the mixture of WSSV and rPenmonPEN5 inhibited the propagation of WSSV only at 6.25μM but not at higher concentration of the protein. Taken together, the results suggest a possible role of PenmonPEN5 in the shrimp's antiviral immunity but its defense mechanism requires further investigation. "

Abstract: เพปไทด์ต้านจุลชีพ (Antimicrobial peptide หรือ AMP) ทำหน้าที่สำคัญในการต้านการรุกรานของเชื้อจุลชีพในระบบภูมิคุ้มกันแบบไม่จำเพาะ จากฐานข้อมูล Expressed Sequence Tag database ของกุ้งกุลาดำ (http://pmonodon.biotec.co.th) พบเพปไทด์ต้านจุลชีพ ได้แก่ ครัสติน (crustin) ไลโซไซม์ (lysozyme) แอนติไลโพพอลิแซ็กคาไรด์ แฟกเตอร์ (antilipopolysaccharide factor, ALF) และพีเนียดิน (penaeidin, PEN) เมื่อศึกษาการแสดงออกของยีนเหล้านี้ในกุ้งที่ได้รับเชื้อไวรัสตัวแดงดวงขาว (WSSV) ด้วยเทคนิค semi-quantitative RT-PCR พบยีน ALFPm3, ALFPm6 และ PenmonPEN5 มีการแสดงออกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญหลังจากกุ้งได้รับเชื้ัอ WSSV ในการศึกษานี้สนใจศึกษาลักษณะสมบัติและการต้านไวรัสจุดขาวของ PenmonPEN5 จากการศึกษาการจัดเรียงตัวของยีน PenmonPEN5 ด้วยวิธี PCR และ genome walking พบว่ายีนนี้ประกอบด้วย 1 intron และ 2 exon ส่วนบริเวณปลาย 5' ของยีนพบโปรโมเตอร์ และส่วนที่ทำหน้าที่ควบคุมการแสดงออกของยีนที่สร้างเพปไทด์ต้านจุลชีพ บริเวณ GATA 3 ตำแหน่ง บริเวณ GATA-3 Activator protein 1 (AP-1) และ dorsal transcription binding sites อย่างละ 2 ตำแหน่ง จากกาารศึกษาการแสดงออกของยีีนนี้ในเนื้อเยื่อและอวัยวะต่างๆ ของกุ้ง พบว่ายีน PenmonPEN5 มีการแสดงออกมากขึ้นประมาณ 1.8 เท่าที่เวลา 24 ชั่วโมงหลังกุ้งได้รับเชื้อ WSSV เพื่อศึกษาหน้าที่ของ PenmonPEN5 ในกุ้งเมื่อได้รับเชื้อ WSSV จึงยับยั้งการแสดงออกของยีนนี้ด้วยอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อยีน Penmon PEN5 ส่งผลให้จำนวนของเชื้อ WSSV ในเม็ดเลือดกุ้งที่ไม่มีการแสดงออกของยีนนี้เพิ่มขึ้นประมาณ 1.9 เท่า เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม นอกจากนี้ยังได้ทดสอบสมบัติในการยับยั้งการติดเชื้อ WSSV ในเซลล์ปฐมภูมิจากเม็ดเลือดกุ้ง โดยทำการสร้างรีคอมบิแนนท์โปรตีนของ PenmonPEN5 (rPenmonPEN5) ในระบบของยีสต์ Pichia pastoris และทำบริสุทธิ์ด้วยวิธี cation exchange chromatography โปรตีนที่ได้มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก Micrococcus luteus และ Aerococcus viridans และนำไปทดสอบสมบัติในการยับยั้งการติดเชื้อ WSSV ในเซลล์ปฐมภูมิจากเม็ดเลือดของกุ้งโดยใช้เทคนิค RT-PCR ติดตามยีนของโปรตีนที่ผิวไวรัสตัวแดงดวงขาว (VP28) พบว่า rPenmonPEN5 ความเข้มข้น 6.25 ไมโครโมลาร์ สามารถยับยั้งการเพิ่มจำนวนของ WSSV ได้ แต่ที่ความเข้มข้นสูงไม่เกิดการยับยั้ง จากผลการศึกษาชี้ให้เห็นว่า PenmonPEN5 น่าจะมีบทบาทสำคัญในกระบวนการต่อต้านเชื้อ WSSV ในกุ้งกุลาดำแต่จะต้องศึกษากลไกการทำงานต่อไป

Chulalongkorn University. Office of Academic Resources

Address: BANGKOK

Email: cuir@car.chula.ac.th

Name: Anchalee Tassanakajon

Role: advisor

Name: Premruethai Supungul

Role: advisor

Created: 2010

Modified: 2014-10-17

Issued: 2014-07-25

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Chulalongkorn University

©copyrights Chulalongkorn University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	noppawan_wo.pdf	5.39 MB	15	2020-03-01 13:56:36

ใช้เวลา

0.042584 วินาที