Tepidimicrobium xylanilyticum BT14 and its xylanolytic and cellulolytic enzyme system

Tepidinicrobium xylanilyticum BT14 และระบบไซลาโนไลติกและเซลลูโลไลติกเอนไซม์

Name: Paripok Phitsuwan

Name: ปริปก พิศสุวรรณ

keyword: Alkalothermophilic bacterium

Abstract: This work was conducted in order to learn more about natural plant biomass utilization(degradation) by microorganisms using Tepidimicrobium xylanilyticum BT14 as a model. A strictly anaerobic, alkaliphilic, thermophilic bacterium, strain BTI4, was isolated from a soil samples collected in a shrimp cultivation pond in Bangkuntien, Bangkok, Thailand. Cells of strain BT14 were straight to slightly curved rods with 2.0-5.0 um in length and 0.1-0.3 um in width and occurred singly. Formation of spores was observed. Flagella were not present. The temperature range for growth was 45-70 C, with optimum at 60 C. The pH range for growth was 6.5-10.5, with optimum at 9.0. Casein, yeast extract, and a variety of carbohydrates were utilized. Thiosulfate and sulfate were reduced to H2S. Ethanol and acetate were the major fermentation products. The cell wall peptidoglycan comprised meso-diaminopimelic acid. The G + C content was 38.4 mol%. Based on 16S rRNA gene sequence similarity, strain BT 14 was classified into the cluster XII of the order Clostridiales, closely related to Tepidimicrobium xylanilyticum (99%), T. Jerriphilum (93%), Soehngenia saccharolytica (91%), Clostridium ultanae (91%), Sporanaerobacter acetigens (90%), and Tissierella praucuta (90%). On the basis of morphological, biochemical, physiological characteristics, and phylogenetic analyses, it is permitted to place strain BT14 to T xylanilyticum species, representing a new type strain of this species. Cellular behaviors and a xylanolytic-cellulolytic enzyme system of T. xylanilyticum BT14 towards xylan-rich plant biomass degradation were characterized. During the exponential growth phase, the bacterial cells were bound tightly to the growth substrate where the degradation zones appeared mostly around the cells, indicating that the xylanolytic-cellulolytic enzyme system was linked to the cell surfaces. Interestingly, several cells appeared to secrete extracellular matrix to connect to their neighbors, and the matrix disappeared when cells passed to the stationary growth phase. Cat ionizedferritin staining resulted in a dense assembly of bulbs, protuberance-like structures on the growing bacterial cell surfaces. The cell-associated proteins derived by sonication contained predominated xylanase with relatively low carboxymethyl-cellulase (CMCase) activities, suggesting that the xylanolytic-cellulolytic enzyme system occurred as a cell-associated enzyme. By means of gel-filtration chromatography, a high molecular mass protein with the estimated size of 2000 kDa was retrieved from the cellassociated enzymes, and it appeared as a single protein band on non-denaturing gel. However, more bands were obtained after the protein was boiled with sodium dodecyl sulfate and Beta-mercaptoethanol-which contained 4 xylanases and one CMCase-suggesting that these proteins were organized as a multienzyme complex (MEC) in natural form. Additionally, the predominated xylanolytic MEC preferred binding to cellulose rather than xylan The free cellulolytic and xylanolytic enzyme was also detected when T xylanilyticum BT14 was grown on cornhusks under anaerobic conditions. Crude enzyme containing cellulase and xylanase of the strain BT14 was active in broad ranges of pH and temperature. The optimum conditions for cellulase and xylanase activities were pH 8.0 and 9.0 at 60 C, respectively. The crude enzyme had the ability to bind to cellulose and xylan. The analysis of native-PAGE and native-zymograms indicated the cellulosebinding protein showing both cellulase and xylanase activities, whereas SDS- PAGE zymograms showed 4 bands of cellulases and 5 bands of xylanases. The crude enzyme from the strain BT14 showed effective degradation of plant biomass. When grown on corn husks at pH 9.0 and 60 C under anaerobic conditions, the strain BT14 produced ethanol and acetate as the main fermentation products.

Abstract: งานวิจัยนี้มีจุดประสงค์เพื่อศึกษากลไกการย่อยสลายพืชชีวมวลในธรรมชาติเพื่อนำไปใช้ประโยชน์ โดยใช้เชื้อ Tepidinicrobium xylanilyticum BT14 เป็นตัวอย่างในการศึกษา เชื้อสายพันธุ์ BT14 เป็นเชื้อแบคทีเรียที่ไม่ต้องการอากาศในการเจริญเติบโต ชอบด่าง และอุณหภูมิสูง คัดแยกมาจากตัวอย่างดินบริเวณบ่อเพาะเลี้ยงกุ้ง เขตบางขุนเทียน กรุงเทพมหานครฯ ประเทศไทย เซลล์มีรูปร่างท่อน และอาจมีขอบมนเล็กน้อย มีขนาดความยาวในช่วง 2.0-5.0 ไมโครแมตรและ ขนาดความกว้างในช่วง 0.1-0.3 ไมโครเมตร อยู่เป็นเซลล์เดี่ยว มีการสร้างเอนโดสปอร์และไม่มี แฟลกเจลลา สามารถเจริญเติบโตได้ในช่างอุณหภูมิระหว่าง 45-70 องศาเซลเซียสโดยมีอุณหภูมิ ที่เหมาะสมในการเจริญที่ 60 องศาเซลเซียส และช่วง pH ระหว่าง 6.5-10.5 โดยมี pH ที่เหมาะสม คือ 9.0 สามารถใช้เคซีน ยีสต์กสกัด และคาร์โบไฮเดรตได้หลายชนิด รีดิวซ์ไธโอซัตเฟต และซัล เฟตเป็นก๊าซไฮโดรเจนไดออกไซด์ มีเอทานอลและอะซีเดตเป็นผลิตภัณฑ์หลักที่ได้จากกระบวน การหมัก ผนังเซลล์เปปทิโดไกลแคนมีกรดมีโซ-ไดอะมโนพิมีลิก เป็นองค์ประกอบและมีปริมาณ G+C 38.4 mol% จากการศึกษาความคล้ายคลึงของลำดับยีน 16S rRNA พบว่าเชื้อสายพันธุ์ BT14 จัดอยู่ในกลุ่ม XII (Cluster XII) ของ order Clostridiales มีความสัมพันธ์ใกล้เคียงกับ Tepidimicrobium xylanilyticum (99%), T. ferriphilum (93%), Soehngenia saccharolytica (91%), Clostridium ultanae (91%), Sporanaerobacter acetigens (90%), and Tissierella praucuta (90%) เมื่อพิจารณาจากคุณลักษณะทางสัณฐาน ชีวเคมี สรีระและการวิเคราะห์วิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิต พบว่า เชื้อแบคทีเรียสายพันธุ์ BT14 จัดเป็นเชื้อสายพันธุ์ของ genus Tepidimicrobium และ species T. xylanilyticum การศึกษาคุณลักษณะทางพฤติกรรมและระบบเซลลูโลไลติกและไซลาโนไลติกเอนไซม์ของ T. xylanilyticum BT14 ระหว่างการย่อยสลายพืชชีวมวลที่มีปริมาณไซแลนสูงพบว่า ในช่างการเจริญ แบบ exponential growth เซลล์จะยึดเกาะอย่างแน่นหนาบนพืชชีวมวลและพบบริเวณที่ถูกย่อย สลายส่วนใหญ่อยู่รอบๆตัวเซลล์ซึ่งคาดว่า ระบบเซลลูโลไลติกและไซลาโนไลติกเอนไซม์อยู่บน ผิวเซลล์ นอกจากนี้ สิ่งที่น่าสนใจอย่างยิ่ง คือ เซลล์จำนวนมากมีการสร้าง extracelllular matrix เชื่อมกันระหว่างเชลล์และ extracellular matrix หายไปเมื่อเซลล์เข้าสู่ช่วงการเจริญแบบ stationary growth เมื่อใช้เทคนิค cationized-ferritin staining ตรวจสอบผิวเซลล์ที่กำลังเจริญ พบว่า มีโครง สร้างกลุ่มก้อนยื่นออกจากผิวเซลล์ การเตรียมโปรตีนจากผิวเซลล์ด้วยเทคนิค Sonication และนำ มาตรวจสอบกิจกรรมทางเอนไซม์ พบว่า โปรตีนที่เตรียมได้มีกิจกรรมของเอนไซม์ไซลาเนสสูง และตรวจพบกิจกรรมเอนเไซม์คาร์บอกซีเมธิลเซลลูเลสเล็กน้อย แสดงให้เห็นว่าระบบเซลลูโลไล ติกและไซลาโนไลติกเอนไซม์เกาะอยู่บริเวณผิว เซลล์ เมื่อตรวจสอบโปรตีน (เอนไซม์) บริเวณ ผิวเซลล์ด้วยเทคนิคโคมาโตกราฟฟี โดยใช้ gel filtration สามารถแยกโปรตีนขนาดใหญ่ และมี มวลโลเลกุลประมาณ 2000 กิโลตาดตัน จากการนำโปรตีนขนาดใหญ่ไปตรวจสอบด้วยเทคนิค gel electrophoresis พบว่า มีโปรตีนหนึ่งแถบปรากฎบน non-denaturing gel แต่เมื่อนำโปรตีน ดังกล่าวไปต้มเดือดในบัฟเฟอร์ที่มี sodium dodecyl sulphate และ Bata-mercaptoethanol เป็น ส่วนประกอบ พบว่ามีโปรตีนเกิดขึ้นหลายแถบบน denaturing gel โดยโปรตีนอย่างน้อย 4 แถบ มีกิจกรรมของไซลาเนสและโปรตีนอย่างน้อยหนึ่งแถบมีกิจกรรมของคาร์บอกซีเมธิลเซลลูเลส แสดงว่า เอนไซม์และโปรตีนอื่นน่าจะอยู่รวมกันเป็นกลุ่มก้อนในโปรตีนขนาดใหญ่หรืออาจเรียก ว่าเป็นเอนไซม์เชิงซ้อนในสภาพธรรมชาติ นอกจากนี้เอนไซม์เชิงซ้อนที่มีกิจกรรมของไซลาเนส สูงมีความสามารถจับกับเซลลูโลโลสได้ดีกว่าไซแลน ระบบเซลลูโลไลติกและไซลาโนไลติกเอนไซม์สามารถตรวจพบได้ในรูปอิสระ (ไม่ยึดติดกับผิว เซลล์) เอนไซม์หยาบที่พบในน้ำเลี้ยงมีกิจกรรมของเซลลูเลสและไวลาเนสที่ทำงานได้ในช่วง pH และอุณหภูมิกว้าง สภาวะที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์เซลลูเลสและไซลาเนสคือ pH 8.0 และ 9.0 ที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส ตามลำดับ เอนไซม์หยาบมีความสามารถจับกับ เซลลูโลสและไซแลน จากการวิเคราะห์ด้วยเทคนิค native -PAGE และ native zymogram พบว่ามีโปรตีนหนึ่งแถบที่จับกับเซลลูโลส แสดงกิจกรรมของเซลลูเลสและไซลาเนสและเมื่อ ตรวจสอบโปรตีนดังกล่าวด้วย SDS-zymogram พบว่า มีโปรตีนอย่างน้อย 4 แถบแสดงกิจกรรม ของเซลลูเลส และมีโปรตีนอย่างน้อย 5 แถบแสดงกิจกรรมของไซลาเนส เอนไซม์หยาบมีความ สามารถในการย่อยพืชชีวมวลที่ไม่ผ่านการปรับสภาพ นอกจากนี้ เมื่อเลี้ยงเชื้อในอาหารที่มีเปลือก ข้าวโพคเป็นแหล่งคาร์บอน ที่สภาวะไร้อากาศที่ pH 9.0 และอุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส ผลิต ภัณฑ์หลักที่ได้จากการหมักคือ เอทานอลและอะซีเตต

King Mongkut's University of Technology Thonburi. KMUTT Library

Address: BANGKOK

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: Khanok Ratanakhanokchai

Role: Advisor

Created: 2012

Modified: 2556-07-24

Issued: 2013-06-29

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: BCT254

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemical Technology

Grantor: King Mongkut's University of Technology Thonburi

©copyrights King Mongkut's University of Technology Thonburi

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	BCT254.pdf	1.27 MB	24	2024-05-24 12:46:39
2	BCT254ab.pdf	45.04 KB	3	2022-08-20 12:29:50

ใช้เวลา

0.025133 วินาที