การแยกสารแบคเทอริโอซินจากเชื้อ Weissella confusa CP3-1 และการทำให้บริสุทธิ์

Seperation and purification of bacteriocin from weissella confusa CP3-1

Name: อาภากร แซ่เอี้ย

keyword: Weissella confusa CP3-1

ThaSH: แบคทีริโอซิน -- การทำให้บริสุทธิ์

ThaSH: แบคทีเรียกรดแล็กติก -- การทดสอบ

Abstract: Weissella confusa CP3-1 เป็นแบคทีเรียกรดแลคติกแกรมบวกซึ่งคัดแยกมาจาก ไส้กรอกอีสาน สามารถผลิตแบคเทอริโอซินยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียทดสอบ Bacillus cereus และ Staphylococcus aureus ได้ โดยงานวิจัยนี้ได้ศึกษาถึงการเจริญและปริมาณ ของ Yeast Extract (YE) ที่เหมาะสมต่อการสร้างสารแบคเทอริโอซิน ก่อนนำไปทำให้บริสุทธิ์ เพื่อวิเคราะห์หาน้ำหนักโมเลกุล และภาพผลของการยับยั้งแบคทีเรียทดสอบด้วยสาร แบคเทอริโอซิน โดย Scanning Electron Microscope พบว่า ในอาหาร TSB ที่เติมด้วย 5% YE มีค่าการเจริญสูงสุดที่ OD600 nm เท่ากับ 0.376 ± 0.024 ที่ 24 ชม โดยจะให้ค่า pH ระหว่าง การเจริญไม่แตกต่างกับ pH เริ่มต้น (6.74-6.91) ส่วนอาหาร TSB ที่เติม 2% YE มีผลยับยั้ง B. cereus ได้สูงสุดเท่ากับ 1.04 ± 0.06 BU/ml ที่ 24 ชั่วโมง ส่วนการยับยั้ง S. aureus พบใน อาหาร TSB ทุกความเข้มข้นของ Yeast Extract ที่ 24 ชั่วโมง โดยมีค่าสูงสุดใน 5% YE เท่ากับ 4.46 ± 0.17 BU/ml และ 1% YE มีค่าเท่ากับ 3.92 ± 0.19 BU/ml ตามลำดับ อย่างไรก็ตาม ได้เลือกอาหาร TSB ที่เติม 2% YE เลี้ยงเชื้อเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในการขยายขนาดการผลิต เพื่อสร้างแบคเทอริโอซิน เนื่องจากพบกิจกรรมซึ่งยับยั้งได้ทั้งเชื้อ B. cereus และ S. aureus โดยส่วนกรองใสจากอาหาร TSB ที่เติม 2% YE พบว่ามีกิจกรรมการยับยั้งเชื้อ B. cereus และ S. aureus เท่ากับ 1.231 ± 0.314 BU/ml และ 0.935 ± 0.197 BU/ml ตามลำดับ เมื่อนำ ส่วนกรองใสไปตกตะกอนโปรตีนด้วย Ammonium Sulfate พบว่า ค่ากิจกรรมการยับยั้ง แบคทีเรียทดสอบทั้ง 2 มีค่าเพิ่มมากขึ้น โดยการยับยั้ง B. cereus พบในตะกอนโปรตีนที่ 40% (NH4)2SO4 ซึ่งมีปริมาณโปรตีนเท่ากับ 4.443 ± 0.005 mg/ml มีค่าเท่ากับ 3.313 ± 0.027 BU/ml ส่วนการยับยั้ง S. aureus พบในตะกอนโปรตีนที่ 40% และ 60% (NH4) 2SO4 ซึ่งมีปริมาณโปรตีนเท่ากับ 4.992 ± 0.032 mg/ml มีค่าเท่ากับ 3.364 ± 0.026 BU/ml และ 3.389 ± 0.020 BU/ml ตามลำดับ โดยไม่แตกต่างกันมากนัก การแยกโปรตีนใน SDS-PAGE เบื้องต้นพบว่า โปรตีนมีความบริสุทธิ์มากขึ้น จากนั้นแยก Fraction ด้วยวิธี Anion Exchanger Chromatography โดยใช้ DEAECellulose เป็นเรซิน พบว่า สารละลายตะกอนที่ 40% (NH₄) ₂ SO₄ มีปริมาณโปรตีนในช่วงFraction ที่ 5-12 ส่วนสารละลายตะกอนที่ 60% (NH4)2SO4 มีปริมาณโปรตีนในช่วง Fraction ที่ 7-17 นำ Fraction ดังกล่าวไปหาค่ากิจกรรมการยับยั้งแบคทีเรียทดสอบ พบว่าตะกอน 40% (NH₄) ₂SO₄ ที่ Fraction 10 มีปริมาณโปรตีนมากที่สุดเท่ากับ 5.246 ± 0.046 mg/ml และมีค่ากิจกรรมการยับยั้ง B. cereus สูงที่สุดเช่นกัน เท่ากับ 5.523 ± 0.185 BU/ml ส่วนกิจกรรม การยับยั้ง S. aureus พบใน Fraction ที่ 6 ซึ่งมีปริมาณโปรตีนเท่ากับ 3.952 ± 0.026 mg/ml มีค่ากิจกรรมการยับยั้งได้สูงที่สุด เท่ากับ 6.578 ± 0.098 BU/ml ซึ่งจะพบว่าตะกอนโปรตีนที่ 40% (NH₄) ₂SO₄จะแสดงผลกิจกรรมการยับยั้งได้ทั้งเชื้อ S. aureus และ B. cereus แต่จะพบ การยับยั้งสูงในเชื้อ S. aureus ส่วนตะกอนโปรตีนที่ 60% (NH₄) ₂SO₄การยับยั้งเชื้อ B. cereus พบใน Fraction ที่ 9 ซึ่งมีปริมาณโปรตีนเท่ากับ 5.276 ± 0.080 mg/ml มีค่ากิจกรรมการยับยั้งได้สูงที่สุด เท่ากับ 4.392 ± 0.008 BU/ml และการยับยั้ง S. aureus พบใน Fraction ที่ 14 ซึ่งมีปริมาณโปรตีน เท่ากับ 6.820 ± 0.118 mg/ml มีค่ากิจกรรมการยับยั้งได้สูงที่สุด เท่ากับ 3.305 ± 0.020 BU/ml โดยจะพบว่าตะกอนโปรตีนที่ 60% (NH₄) ₂SO₄จะแสดงผลกิจกรรมการยับยั้ง B. cereus ได้ดีกว่า S. aureus และจากการหาน้ำหนักโมเลกุลของสารแบคเทอริโอซินที่ได้จากการแยก Fraction ต่าง ๆ พบว่า มีน้ำหนักอยู่ในช่วงประมาณ 3 kDa สำหรับผลของสารแบคเทอริโอซินที่มีต่อแบคทีเรียเป้าหมายภายใต้กล้องจุลทรรศน์ อิเลคตรอนแบบส่องกราด พบว่า การยับยั้งเชื้อ B. cereus มีกลไกเหมือนกับไนซิน คือทำลาย การสร้างผนังเซลล์ทำให้เยื่อหุ้มเซลล์เกิดเป็นรู แต่สำหรับการยับยั้ง S. aureus แบคเทอริโอซิน มีผลทำให้ S. aureus เปลี่ยนแปลงรูปร่างทำให้เซลล์ยืดยาวขึ้น โดยทั้งนี้การยับยั้งแบคทีเรีย ทดสอบเห็นได้ชัดเจนในชั่วโมงที่ 24 ในขณะที่ชั่วโมงที่ 6 ยังไม่พบการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ทั้ง B. cereus และ S. aureus ซึ่งสอดคล้องกับการทดสอบค่า Bacteriocin Unit ในข้างต้น

Abstract: Weissella confusa CP3-1, is gram-positive lactic acid bacteria, isolated from a Thai fermented sausage. Previous report showed that it produced bacteriocin-like activity against two foodborne pathogens i.e. Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. This study was then aimed at optimizing the percentage of yeast extract and incubation time that provided the highest bacteriocinogenic activity prior to separation and purification. Maximum of growth was found when CP3-1 was cultured in TSB with 5% yeast extract for 24h (OD₆₀₀ = 0.376 ± 0.024). Whereas the results of bacteriocin activity showed that the filtrate of 2% YE started to exhibit highest inhibition against B. cereus at 1.04 ± 0.06 BU/ml at 24 hour. During the growth pH was not different from the initial pH (6.7-7.0). In contrast inhibition of S. aureus displayed in every percentage of yeast extract, highest activity showed in the filtrate of 5% YE at 4.46± 0.17 BU/ml after 24 hour. The second best was the filtrate of 1% YE which gave activity of 3.92± 0.19 BU/ml. However, TSB added with 2% YE cultured for 24h was selected as an appropriate medium to produce large scale bacteriocin due to the filtrate could inhibit both B. cereus and S. aureus. Inhibition activities of filtrate from TSB with 2% YE against B. cereus was at 1.231 ± 0.314 BU/ml and against S. aureus was 0.935 ± 0.197 BU/ml. Thereafter the filtrate was precipitated by ammonium sulfate. An increase of activity was detected in both 40% and 60% ammonium salt precipitates. For B. cereus the activity was only found in 40% (NH₄) ₂SO₄ precipitate at 3.313 ± 0.027 BU/ml, whereas S. aureus was found in both 40% and 60% (NH₄) ₂SO₄ precipitates at 3.364 ± 0.026 BU/ml and 3.389 ± 0.020 BU/ml, respectively. According to protein bands appeared in SDS-PAGE they became more purified. Resuspended precipitates were then fractionated in Anion exchange chromatography of DEAE-cellulose column. For 40% salt precipitate high protein peaks were detected in the fraction of 5-12, while in 60% salt precipitate such peaks were found in the fraction of 7-17. The 10^th fraction of 40% salt precipitate had highest protein amount at 5.246 ± 0.046 mg/ml and showed highest inhibition against B. cereus at 5.523 ± 0.185 BU/ml. However the activity against S. aureus was found high in the 6^th fraction at 6.578 ± 0.098 BU/ml where the protein amount was 3.952 ± 0.026 mg/ml. In addition the 9^th fraction of 60% salt precipitate showed highest bacterioncin activity against B. cereus at 4.392 ± 0.008 BU/ml with the protein content of 5.276 ± 0.080 mg/ml, whereas the highest inhibition against S. aureus was found in fraction 14 with 3.305 ± 0.020 BU/ml where the protein amount was 6.820 ± 0.118 mg/ml. Purify bacteriocin was determined approximate 3 kDa. An observation of bacteriocin mechanism on the scanning electron micrographs showed pore formation on B. cereus cell wall. Whereas morphological deform in S. aureus appeared that cocci shape altered into rod shape. These results occurred at 12 hour of incubation and clearly observed at 24 hour which agreed to the pervious results on bacteriocin activity test.

มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าพระนครเหนือ. สำนักหอสมุดกลาง

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: library@kmutnb.ac.th

Name: สาวิตรี วทัญญูไพศาล

Role: ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์

Email : svt@kmutnb.ac.th

Name: สุริยา ฤธาทิพย์

Role: ที่ปรึกษาวิทยานิพนธ์

Email : syr@kmutnb.ac.th

Created: 2554

Modified: 2556-02-20

Issued: 2556-02-20

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: วพ MBIT อ634ซ

tha

DegreeName: วิทยาศาสตร์มหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: เทคโนโลยีอุตสาหรรมชีวภาพ

Grantor: มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าพระนครเหนือ

©copyrights มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าพระนครเหนือ

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	B15616691.pdf	2.75 MB	46	2019-06-28 22:06:26

ใช้เวลา

0.02575 วินาที