การศึกษายีนที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์ย่อยแป้ง และคุณสมบัติของเอนไซม์ย่อยแป้งในแบคทีเรียแลคติก Lactobacillus plantarum

Study of Amylolytic Enzyme Encoding Genes and Properties of Amylolytic Enzyme from Lactobacillus plantarum

Name: กนก วงศ์รัฐปัญญา

Name: Kanok Wongratpanya

keyword: แบคทีเรียนแลคติกที่มีความสามารถในการย่อยแป้ง

Abstract: งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความหลากหลายของยีนที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์ย่อยแป้ง และ คุณลักษณะของเอนไซม์ย่อยแป้งในแบคทีเรียแลคติก Lactobacillus plantarum จากแบคที่เรียแลคติก ที่มีความสามารถในการย่อยแป้งทั้งหมด 124 ไอโซเลท ซึ่งแยกได้จากตัวอย่างอาหารหมัก ผัก ปลไม้ ผลิตภัณฑ์นม และธัญพืช เมื่อนำเชื้อมาคัดเลือกสายพันธ์ที่ผลิตเอนไซม์ย่อยแป้ง และสร้างกรดจาก แป้งมันสำปะหลังสูงสุดพบว่า แบคทีเรียนแลคติก Weissella sp. รหัส FPT2 มีกิจกรรมเอนไซม์ย่อย แป้งสูงสุดที่ 11.56 ยูนิตต่อมิลลิลิตร และ L.fermentum รหัส V3R มีความสามารถในการสร้างกรดได้ สูงที่สุดเท่ากับ 3.31 เปอร์เซ็นต์ (w/v) จากการศึกษาการกระจายตัวของยีนที่ควบคุมการสร้างเอนไซม์ ย่อยแป้งในแบคทีเรียแลคติก L. plantarum ซึ่งมีรายงานว่ามีความหลากหลายของยีนที่ควบคุมการ สร้างเอนไซม์ย่อยแป้งสูง พบว่าเชื้อส่วนมากสามารถตรวจพบยีน amy1 amy2 agl3 และ agl 4 และจาก การเทียบเคียงลำดับนิวคลีโอไทด์ของผลผลิต PCR พบว่า ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน amyA amyl และ amy2 มีความแตกต่างกัน แต่พบกรดอะมิโนอนุรักษ์จำนวน 3 ตำแหน่งในโดเมนเร่งของโปรตีนทั้ง 3 ดังกล่าว นอกจากนี้ยีนกลุ่ม agl ก็พบความแตกต่างของลำดับนิวคลีโอไทด์เช่นกัน จากการทำบริสุทธิ์ เอนไซม์ย่อยแป้งจาก L.plantarum รหัส F17R และ S7R โดยคอลัมน์ starch - celite พบเอนไซม์ย่อย แป้ง มีขนาดมวลโลเลกุลประมาณ 55 กิโลดาลตัน และ 51 กิโลดาลตันตามลำดับ เอนไซม์ย่อยแป้ง จากเชื้อรหัส F17R มี pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานของเอนไซม์เท่ากับ 7.0 และ 45 องศา เซลเซียส ส่วนเอนไซม์ย่อยแป้งเชื้อรหัส S7R มี pH และอุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำงานเท่ากับ 6.0 และ 30 องศาเซลเซียสตามลำดับ เอนไซม์ย่อยแป้งจากแบคทีเรียแลคติกทั้งสองสายพันธุ์มี กิจกรรมเอนไซม์คงเหลือ 30-50 เปอร์เซ็นต์ หลังจากบ่มในช่วง pH 4.0-10.0 เป็นเวลา 30 นาที และ เอนไซม์ย่อยแป้งจากเชื้อรหัส F17R มีความคงตัวต่ออุณหภูมิสูงกว่าเอนไซม์ย่อยแป้งจากเชื้อรหัส S7R เนื่องจากเอนไซม์มีกิจกรรมคงเหลือร้อยละ 90 เมื่อบ่มที่อุณหภูมิ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที ในขณะที่เชื้อ S7R มีกิรรมเอนไซม์คงเหลือเพียงร้อยละ 20 เมื่อบ่มในสภาวะเดียวกัน จาก การศึกษาผลของโลหะต่อกิจกรรมเอนไซม์ย่อยแป้งพบว่า Ca2+ มีผลในการส่งเสริมกิจกรรมเอนไซม์ ย่อยแป้งจากเชื้อรหัส F17R สูงถึงร้อยละ 194 และ Ba2+ Cu2+ และ Zn2+ มีผลในการส่งเสริมกิจกรรม เอนไซม์จากเชื้อ S7Rสูงร้อยละ 121 123 และ 115 ตามลำดับ และจากการศึกษาความจำเพาะต่อสาร ตั้งต้นของเอนไซม์ย่อยแป้งพบว่า เอนไซม์ทั้งสองชนิดสามารถย่อยแป้งมันสำปะหลัง แป้งข้าวเจ้า แป้งข้าวโพด แป้งข้าวเหนียว อะไมโลส และอะไมโลเพคตินได้ และผลิตภัณฑ์หลักที่ได้จากการย่อย solubie starch ด้วยเอนไซม์ย่อยแป้งจากเชื้อทั้งสองสายพันธุ์ ประกอบด้วยน้ำตาลมอลโตโอลิโกแซก คาไรด์ชนิด G2 G3 และ G4

Abstract: The aims of this research were to study genetic diversity of amylolytic enzyme encoding genes and characterize amylolytic enzyme from Lactobacillus plantarum. A total of 124 amylolytic lactic acid bacteria isolated from fruits, vegetables, dairy products, cereals, and fermented starches were screened for the highest amylolytic enzyme and acid producing strains. The results showed that, Weissella sp. FPT2 exhibited the highest amylolytic activity of 11.56 U/mL and L. fermenturn V3R could produce the highest lactic acid of 3.31 % (w/v). The study of amylolytic enzyme encoding genes distribution among L. platarum, which has been reported to have high amylolytic genes diversity, revealed that amyl, amy2, agl3, and agl4 genes were the most frequently found in L. plantarum isolates. Sequence analysis and alignment of PCR products revealed no homology between amy 1, amyA, and amy 2 genes, however, three conserved amino acids were observed in the catalytic domain. No sequence homology was also observed among agl genes. The molecular weights of the purified amylolytic enzymes from L. plantarum strain F17R and S7R using a starch - celite column were estimated as 55 kDa and 51 kDa, respectively. The optimum pH and temperature for amylolytic activity of strain F17R were 7.0 and 45 C, respectively, and of strain S7R were pH 6.0 and 30 C, respectively. The amylolytic enzymes from both strains retained 30 - 50 % residual activities after 30 min of incubation at pH ranging from 4.0 to 10.0. The enzyme from strain F17R showed higher thermal stability than that of strain S7R as it retained 90% residual activity at 60 C for 30 min, while, amylolytic enzyme from strain S7R retained only 20% residual activity under the same condition. The effect of metal ions on enzyme activity revealed that ca2+ could improve amylolytic activity of strain F17R to up to 194%, while Ba 2+,Cu2,+ , and zn2+ enhanced amylolytic activity of strain S7R to 121, 123 and 115%, respectively. The substrate specificity of amylotytic enzymes showed that both enzymes catalyzed the degradation of cassava starch, peddy rice starch, corn starch, sticky rice starch, amylose and amylopectin. The major hydrolysis products of soluble starch from both enzymes were a mixture of malto-oligosaccharides, which are G2, G3, and G4.

มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. สำนักหอสมุด

Address: กรุงเทพมหานคร

Email: info.lib@mail.kmutt.ac.th

Name: นงพงา คุณจักร

Role: อาจารย์ที่ปรึกษา

Created: 2554

Modified: 2555-10-08

Issued: 2555-10-08

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: MIC1008

tha

DegreeName: วิทยาศาสตรมหาบัณฑิต

Level: ปริญญาโท

Descipline: จุลชีววิทยา

Grantor: มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี

©copyrights มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	MIC1008.pdf	3.89 MB	71	2024-12-25 13:10:11
2	MIC1008ab.pdf	123.16 KB	29	2021-12-18 08:15:38

ใช้เวลา

0.034479 วินาที