Investigation on the role of threonine 169 in the reaction catalyzed by pyranose 2-oxidase

การศึกษาบทบาทของกรดอะมิโนทรีโอนีนที่ตำแหน่ง 169 ในการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ไพราโนสออกซิเดส

Name: Warintra Pitsawong

MeSH: Flavoproteins

MeSH: Threonine

LCSH: Pyranose oxidase

Abstract: Pyranose 2-oxidase (P2O; pyranose:oxygen 2-oxidoreductase;) is a covalently-linked flavoenzyme that catalyzes the oxidation of D-glucose and several aldopyranoses by molecular oxygen to 2-keto-aldoses and hydrogen peroxide. Crystallographic studies of pyranose 2-oxidase a 1.8 Ǻ resolution have shown that the active site residue, Thr169, may be important for reductive and oxidative halfreactions. The wild-type P2O prefers D-glucose over D-galactose as an electron-donor substrate. In this study, a series of mutants, Thr169Ser, Thr169Asn, Thr169Gly and Thr169Ala were constructed and expressed for investigating the role of this residue using pre-steady state and steady state kinetics. Pre-steady state kinetics has shown that Thr169 is important for the reductive half-reaction since the rates of the flavin reduction by D-glucose in these mutants were lower than that of the wild-type ~1.5×103-fold and ~20-fold for Thr169Ala and Thr169Gly mutants. However, mutation of this residue seems to improve the oxidation of D-galactose since rate constants associated with the D-galactose oxidation in the Thr169Ser, Thr169Asn, and Thr169Gly mutants are higher than the values of the wild-type. In these mutants, the binding of D-galactose which differs from D-glucose only at the conformation of the O4 hydroxyl group may be improved by the decrease of steric hindrance between the side chain of this residue and the O4 position of D-galactose. Studies of the oxidative half-reaction have shown that this residue is important for the stabilization a C4ahydroperoxyflavin intermediate since all mutants did not show the intermediate formation. Our findings show that while the wild-type enzyme and other mutants follow a Ping-Pong kinetic mechanism, the Thr169Ala mutant exhibits a ternary complex mechanism. This indicates that the product may remain bound to the mutant active site during the oxidative half-reaction. This implies that replacement of Thr169 with alanine significantly affected the microenvironment of the flavin. Measurement of midpoint reduction potentials showed that E 0 m of all mutants were in the same range with the wild-type value except in Thr169Ala where E 0 m of -197 mV was found. This value is ~92 mV more negative than that of the wild-type enzyme, indicating that reduction of the flavin in this mutant is also disfavored thermodynamically.

Abstract: เอนไซม์ ไพราโนส ออกซิเดส (pyranose oxidase; P2O) จากเชื้อรา Trametes Multicolor เป็น เอนไซม์ที่มีฟลาวินไดนิวคลีโอไทล์ (FAD) เป็นโคแฟคเตอร์ ซึ่งเชื่อมต่อกับกรดอะมิโนในตำแหน่งที่ His167 เอนไซม์ในไพราโนส ออกซิเดส เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชั่นของน้ำตาลกลูโคส และ น้ำตาลในกลุ่มแอลโดไพราโนส (aldopyranoses) โดยใช้ออกซิเจน ได้สารผลิตภัณ์เป็นน้ำตาลที่อยู่ในรูปของคีโตน (2-keto-aldoses) และ ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) จากการศึกษาโครงสร้างสามมิติของเอนไซม์ที่มีความละเอียดในระดับ 1.8 อังสตรอม แสดงให้เห็นว่ากรดอะมิโนทรีโอนีนตำแหน่งที่ 169 บริเวณเร่งปฏิกิริยา (active site) น่าจะสำคัญกับ ปฏิกิริยาทั้ง reductive และ oxidative half-reaction นอกจากนี้ การศึกษาในอดีตของปฏิกิริยา wild-type เอนไซม์ ยังพบว่าน้ำตาลกลูโคสเป็นสารตั้งต้นในการให้ อิเล็กตรอนที่ดีกว่าน้ำตาลกาแลกโตส ดังนั้นในงานวิทยานิพนธ์นี้ จึง ได้ทำการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนทรีโอนีน (site-directed mutagenesis) ให้เป็นกรดอะมิโน เซอรีน แอสพารา จีน ไกลซีน และ อะลานีน เพื่อศึกษาการทำงานและหน้าที่ของกรดอะมิโนทรีโอนีน โดยทำการศึกษาทั้งทางด้าน จลนพลศาสตร์ (kinetics) ในช่วงเวลาที่ปฏิกิริยาก่อนถึงสภาพคงตัว (pre-steady state kinetics) และ เมื่อปฏิกิริยา เข้าสู่สภาพคงตัวแล้ว (steady-state kinetics) ข้อมูลจากช่วงเวลาก่อนที่ปฏิกิริยาเข้าสู่สภาพคงตัวแสดงให้เห็นว่า กรดอะมิโนทรีโอนีนตำแหน่งที่ 169 มีความสำคัญต่อการเร่งปฏิกิริยาในส่วนของ reductive half-reaction เนื่องจาก ความเร็วในการส่งผ่านอิเล็กตรอนจากน้ำตาลกลูโคสซึ่งเป็น สารตั้งต้นของปฏิกิริยากับฟลาวินไดนิวคลีโอไทล์ ซึ่งเป็นตัวรับอิเล็กตรอนช้าากว่า wild-type ในทางตรงกันข้ามในปฏิกิริยาของ mutants เมื่อใช้สารตั้งต้นเป็นน้ำตาล กาแลกโทสกลับมีมความเร็วในการให้อิเล็กตรอนที่เร็วกว่าใน ปฏิกิริยาของ wild-type ดังนั้นการเปลี่ยนแปลง กรดอะมิโนทรีโอนีนได้เพิ่มความสามารถในการจับของเอนไซม์กับน้ำตาลกาแลกโทสซึ่งแตกต่างจากน้ำตาล กลูโคสตรงตำแ หน่งที่สี่ของหมู่ไฮดรอกซิล (OH) โดยการลดความ steric ระหว่างกรดอะมิโนทรีโอนีนกับหมู่ไฮ ดรอกซิล ของน้ำตาลกาแลกโทส การศึกษาในส่วนของ Oxidative half-reaction แสดงให้เห็นว่ากรดอะมิโนทรี โอนีนมีส่วนช่วยในการควบคุมการเกิดสารตัวกลางที่เรียกว่า C4a-hydroperoxyflavin เนื่องจากเมื่อทำการเปลี่ยน กรดอะมิโนทรีโอนีนไปเป็นกรดอะมิโนตัวอื่นแล้วไม่สามารถสังเกตุเห็นการเกิดของสารตัวกลางดังกล่าวได้ จาก การศึกษาปฏิกิริยาของ wild-type เอนไซม์ พบว่า กลไกลปฏิกิริยาเป็นแบบ Ping-Pong แต่เมื่อทำการเปลี่ยนกรดอะ มิโนทรีโอนีนเป็นกรดอะมิโนอะลานีนพบว่ากลไกลการเกิดปฏิกิริยาเปลี่ยนเป็น Ternary complex แสดงให้เห็นว่า สารผลิตภัณฑ์อาจจะคงอยู่ภายในบริเวณเร่งขณะที่เกิด Oxidative half-reaction นอกจากนี้การเปลี่ยนกรดอะมิ โนทรีโอนีนเป็นกรดอะมิโนอะลานีนยังส่งผลต่อบริเวณรอบข้างของฟลาวิน เนื่องจากค่าความสามารถในการรับ อิเล็กตรอนน้อยกว่า wild-type ประมาณ 92 มิลิโวล

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pimchai Chaiyen

Role: Thesis Advisors

Created: 2009

Modified: 2553-08-25

Issued: 2010-08-25

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH W277i 2009

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	5037203.pdf	4.06 MB	30	2025-01-22 16:09:20

ใช้เวลา

-0.580567 วินาที