Mutagenic analysis of surface-exposed loop residues in the receptor-binding domain of the bacillus thuringiensis cry4Ba toxin

การเปลี่ยนแปลงยีนเพื่อศึกษากรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องกับความเป็นพิษซึ่งอยู่ในบริเวณห่วงผิวในส่วนที่ 2 ของ โปรตีนชนิด Cry4Ba จากแบคทีเรีย bacillus thuringiensis

Name: Tararat Khaokhiew

MeSH: Mutagenicity Tests

MeSH: Bacillus thuringiensis -- analysis

MeSH: Immunohistochemistry

MeSH: Insecticidal crystal protein Bacillus Thuringiensis

Abstract: Critical surface-exposed loop residues (Pro389 in the β6-β7 loop, Glu417 in the β8–β9 loop, Tyr455 and Asn456 in the β10-β11 loop) in the receptor-binding domain of the Bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin have been demonstrated to be involved in larvicidal activity. The extended mutagenic analysis in this study was carried out to investigate a correlative effect among these critical loop residues on Cry4Ba toxicity. Several different double-loop mutants, P389A/E417A (β6-β7/β8-β9 loops), P389A/Y455A, P389A/N456A (β6-β7/β10-β11 loops), E417A/Y455A and E417A/N456A (β8-β9/β10-β11 loops) were constructed via PCR-based mutagenesis and subsequently were highly expressed in Escherichia coli as 130-kDa protoxins at levels comparable to the wild type toxin. Each double mutant toxin was determined their toxicity against Aedes aegypti mosquito larvae. An almost complete loss in larvicidal activity was observed from all these double mutant toxins. Using immunohistochemical staining with a Cry4Ba specific monoclonal antibody, the double mutant toxins were able to bind to the apical microvilli of the susceptible A. aegypti larval midguts, albeit at lower-binding activity compared to the full-length active toxin. In addition, it was observed via electrochemical sensor that E417A/Y455A double-loop mutant was able to insert and permeabilize the liposomes leading to the release of the entrapped redox species comparable to the Cry4Ba wild-type. Therefore, the dramatic loss of larvicidal activity of E417A/Y455A is likely due to inability to bind to their receptors rather than to pore-forming activity. This study demonstrated that these critical loop residues in Cry4Ba-domain II: Pro389 in β6-β7 loop, Glu417 in β8-β9 loop, Tyr455 and Asn456 in β10-β11 loop are dependently involved in Cry4Ba-receptor binding activity. These results also imply that the Cry4Ba-domain II activity requires more than one loop for the receptor-binding process. It is conceivable that the Cry4Ba-domain II could be divided into two sub-domains. The first sub-domain would consist of the residues which are located on the β2 to β5 (2 loops-β2-β3/ β4-β5) and the other sub-domain would consist of the residues from β1 to α8 and β6 to β11 (4 loops-β1-α8/ β6-β7/ β8- β9/ β10-β11).

Abstract: การศึกษาก่อนหน้านี้พบว่ากรดอะมิโนตรงบริเวณผิวหน้าที่เป็นส่วนเชื่อมต่อระหว่างเบต้าซึ่งอยู่ในส่วนที่ 2 ของโปรตีนชนิด Cry4Ba จาก Bacillus thuringiensis; Pro389, Glu417, Tyr455 Asn456 ในส่วน เชื่อมต่อระหว่างเบต้าที่ 6 ถึงเบต้าที่ 11 มีส่วนเกี่ยวข้องกับความเป็นพิษต่อแมลงที่จำเพาะเจาะจง ใน การศึกษาครั้งนี้ จึงศึกษาความสัมพันธ์ของกรดอะมิโนดังกล่าวที่ผลกระทบต่อการฆ่าลูกยุงและการจับกับ ตัวจับจำเพาะ โดยทำการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนครั้งละสองตำแหน่งพร้อมกันด้วย alanine โดยอาศัยการ เปลี่ยนแปลงยีนด้วยเทคนิค PCR ซึ่งได้แก่ P389A/E417A, P389A/Y455A, P389A/N456A และ E417A/N456A ซึ่งพบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ทั้งหมดที่สร้างใน Escherichia coli มีขนาด 130 kDa โดย อัตราการสร้างใกล้เคียงกับการสร้างโปรตีนชนิดดั้งเดิมและเมื่อทดสอบความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงลาย พบว่า โปรตีนกลายพันธุ์ทั้งหมด ได้สูญเสียความเป็นพิษเกือบทั้งสิ้น เมื่อใช้วิธี immunohistochemistry โดย อาศัยแอนติบอดีที่จำเพาะ พบว่าโปรตีนกลายพันธุ์ที่ไม่สามารถฆ่าลูกน้ำยุงได้นั้น และยังสามารถจับกับ ส่วนบนสุดของเซลล์บุผิวในส่วนท้ายของกระเพาะลูกน้ำยุงลาย แต่การจับกันนั้นมีปริมาณลดลงอย่างชัดเจน ในส่วนของการศึกษาความสามารถที่ทำให้เกิดการแตกของ liposome ของโปรตีนกลายพันธุ์โดยวิธี electrochemistry พบว่าโปรตีนกลายพันธุ์มีความสามารถทำให้เกิดการแตกของ liposome ในปริมาณที่ ใกล้เคียงกับโปรตีนดั้งเดิม ซึ่งแสดงให้เห็นว่าความสามารถในการฆ่าลูกน้ำยุงที่ลดลงของโปรตีนกลายพันธุ์ มาจากการสูญเสียหน้าที่ในการทำงานในส่วนบริเวณที่สองของCry4Ba มากกว่าในส่วนบริเวณที่หนึ่งที่มี หน้าที่ในการทำให้เกิดรูบนผิวเซลล์ของกระเพาะลูกน้ำยุง จากผลการศึกษาทั้งหมดนี้จึงสรุปได้ว่า Pro389 ใน ส่วนเชื่อมต่อระหว่าง β6-β7, Glu417 ในส่วนเชื่อมต่อระหว่าง β8–β9 , Tyr455 และ Asn456 ในส่วนเชื่อมต่อ ระหว่าง β10-β11 มีความเกี่ยวข้องที่พึ่งพากันในการจับกับ receptor และในแต่ละส่วนมีความสำคัญเท่า ๆ กันต่อการทำหน้าที่ของโปรตีน หรืออีกนัยหนึ่งในบริเวณส่วนที่สองของ Cry4Ba ต้องอาศัยส่วนที่เชื่อมต่อ มากกว่าหนึ่งส่วนในการจับกับตัวจับจำเพาะ เพื่อให้การจับสามารถจับได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในการศึกษา ครั้งนี้ได้นำเสนอว่า ในบริเวณส่วนที่สองของ Cry4Ba สามารถแบ่งเป็นส่วนย่อยอีกสองส่วน ส่วนแรก ประกอบด้วยส่วนที่เชื่อมต่อสองส่วนได้แก่ β2-β3/ β4-β5 และส่วนที่สองประกอบด้วยส่วนที่เชื่อมต่อสี่ส่วน ได้แก่ β1-α8/β6-β7/ β8-β9/ β10-β11

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chamras Promptmas

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2553-07-15

Issued: 2010-07-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH T178m 2008

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Medical Technology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636138.pdf	10.54 MB	12	2018-05-29 14:56:15

ใช้เวลา

0.221921 วินาที