Characterization of phospholipase C enzymes from Burkholderia pseudomallei

การศึกษาเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีชนิดที่ 1-3 ในเชื้อ Burkholderia pseudomallei.

Name: Varintip Srinon

MeSH: Burkholderia pseudomallei

MeSH: Melioidosis

MeSH: Respiratory Burst

MeSH: Type C Phospholipases

Abstract: Burkholderia pseudomallei, a gram-negative bacillus is the causative agent of melioidosis, a disease which is recognized as a major public health problem in the northeast of Thailand. This organism secretes several exoenzymes such as protease, lipase and phospholipases C (PLC). From genome sequence analysis, B. pseudomallei carry at least three PLC genes (plc1, plc2 and plc3) on two different chromosomes. PLC enzyme has been suggested to be a key virulence factor in several infectious diseases. However, the role of PLC enzymes in B. pseudomallei pathogenesis is not well defined. In the present study, recombinant plasmids encoding each different B. pseudomallei plc gene have been cloned for analysis of enzyme and hemolytic activity. B. pseudomallei Plc1, Plc2 and Plc3 enzymes are able to hydrolyse phospholipid phosphatidylcholine (PC) but they could not lyses sheep red blood cells, indicating that all three B. pseudomallei PLC enzymes can be classified as PC-PLC and non-hemolytic PLC. Moreover, a B. pseudomallei strain carrying a mutation in plc3 gene, disrupting Plc3 enzyme production, was constructed by insertional inactivation and examined for the ability to survive within host cells. Comparisons of plaque forming efficiency, multinucleated giant cell (MNGC) formation and intracellular localization of B. pseudomallei strains in the infected host cells relative to LAMP-1 (late endosome marker) containing vesicles revealed that B. pseudomallei plc3 knockout mutant exhibited virulence phenotypes similar to the wild-type strain, suggesting that Plc3 enzyme may not play a role in B. pseudomallei escaping from the endocytic vesicle, cell-to-cell-spread and induction of MNGC formation. While the mutant caused more cytotoxic effects to cells, the oxidative burst of neutrophils induced by B. pseudomallei plc3 knockout mutant was significantly impaired when compare with B. pseudomallei wild-type infection. These findings suggest that B. pseudomallei Plc3 enzyme is involved in the induction of oxidative burst in infected host cell.

Abstract: Burkholderia pseudomallei เป็นเชื้อแบคทีเรียกรัมลบรูปแท่ง ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคเมลิออยโดซิสที่พบ การระบาดในภาคตะวันออกเฉียงเหนือของประเทศไทยโดยมีอัตราการตายสูง B. psudomallei สามารถผลิตและ หลั่งเอ็นซัยม์หลายชนิดจากตัวแบคทีเรีย เช่น เอ็นซัยม์โปรติเอส เอ็นซัยม์ไลเปส และเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซี ผล การวิเคราะห์สารพันธุกรรมของเชื้อ B. pseudomallei พบว่าแบคทีเรียชนิดนี้สามารถผลิตเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซี ได้อย่างน้อย 3 ชนิดคือ เอ็นซัยม์ Plc1, Plc2 และ Plc3 ถึงแม้จะมีรายงานความสำคัญของเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลปสซี ต่อกลไกการก่อโรคของเชื้อแบคทีเรียหลายชนิด แต่ข้อมูลการศึกษาเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีต่อกลไกการก่อโรค ของเชื้อ B. pseudomallei ยังมีอยู่น้อยมากดังนั้นการศึกษาครั้งนี้ผู้วิจัยจึงศึกษาเอ็มซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีทั้ง 3 ชนิด โดยอาศัยเทคนิคทางอณูชีววิทยา (Molecular biology) และเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ (Cell culture) ผลการศึกษา พบว่าเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีทั้ง 3 ชนิดมีคุณสมบัติที่เหมือนกัน คือสามารถย่อยสลายฟอสโฟลิปิดชนิด phosphatidycholine และไม่สามารถทำให้เม็ดเลือดแดงของแกะแตกสลายได้ ผลการทดลองดังกล่าวสามารถ สรุปว่าเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีของเชื้อ B. pseudomallei ทั้งสามชนิดเป็นเอ็มซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีชนิด PC-PLC และเป็น non-hemolytic phospholipase C ผู้วิจัยยังได้ทำการศึกษาคุณลักษณะสำคัญของเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซี ชนิด Plc3 ต่อความสามารถของเชื้อ B. pseudomallei ในการอยู่อาศัยได้ภายในโฮสต์เซลล์ โดยการสร้างเชื้อ B. pseudomallei กลายพันธุ์ที่ไม่สามารถผลิตเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีชนิด Plc3 ผลการศึกษาเปรียบเทียบกับเชื้อ B. pseudomallei สายพันธุ์ปกติพบว่า B. pseudomallei plc3 knockout mutant ไม่มีความผิดปกติในการแพร่กระจาย (cell-to-cell spread) จากเซลล์หนึ่งไปยังอีกเซลล์หนึ่งรวมทั้งการก่อให้เกิด multinucleated giant cell (MNGC) ได้ ไม่แตกต่างจากเชื้อ B. pseudomallei สายพันธุ์ปกติ นอกจากนี้ผลการศึกษาด้วยเทคนิค Confocal microscopy พบว่าเชื้อ B. pseudomallei plc3 knockout mutant มีความสามารถในการหลุดรอด (escape) ออกจาก endocytic vesicle ได้ไม่แตกต่างจากเชื้อสายพันธุ์ปกติ ดังนั้น เอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซีชนิด Plc3 จึงไม่เกี่ยวข้องกับกลไกการ หลีกหนีของเชื้อ B. pseudomallei ออกจาก endocytic vesicle อย่างไรก็ตาม ผู้วิจัยพบว่าเอ็นซัยม์ฟอสโฟไลเปสซี ชนิด Plc3 ของเชื้อ B. pseudomallei มีความสำคัญในการก่อให้เกิดความเป็นพิษต่อเซลล์ (cytotoxicity) และ เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นให้เกิดกระบวนการ oxidative burst ในเม็ดเลือดขาวชนิด neutrophil

Mahidol University. Mahidol University Library and Knowledge Center

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Sunee Korbsrisate

Role: Thesis Advisors

Created: 2009

Modified: 2553-07-13

Issued: 2010-07-12

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH V312ch 2009

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4937157.pdf	3.3 MB	13	2018-05-29 14:45:23

ใช้เวลา

0.282936 วินาที