Isolation and characterization of a newly identified class of glutathione transferase in Anopheles dirus

การจัดจำแนกและศึกษาเอนไซม์กลูตาไธโอนทรานสเฟอเรสชนิดใหม่ในยุง Anopheles dirus.

Name: Gulsiri Charoensilp

LCSH: Anopheles Dirus

MeSH: Anopheles

MeSH: Glutathione S-Transferase pi

MeSH: Peroxidase

MeSH: Pyrethrins

Abstract: The insect glutathione S-transferases (GSTs) are of particular interest because of their potential to confer resistance on all the major groups of insecticides. Recently, a cluster of eight insect-specific epsilon class GSTs from Anopheles gambiae has been identified and it was found that they are involved in insecticide resistance. The aim of this study is to isolate and biochemically characterize the function of the GST epsilon four (adGSTE4-4) enzyme including variant isoenzymes from the Thai malaria vector, Anopheles dirus, and to compare the adGSTE4-4 enzyme with GSTE4-4 enzymes from An. gambiae (agGSTE4-4) and Aedes aegypti (aaGSTE4-4). The An. dirus GSTE4-4 wild type and three variants (Pro14Leu, Glu44Lys, and Ile131Thr) were obtained by RT-PCR. After confirmation by sequencing, the RT-PCR products were subcloned into pET3a expression vector. Proteins were expressed, purified, and characterized for kinetic properties, substrate specificities, half life stabilities, and pyrethroid inhibition. The results showed that An. dirus GSTE4-4 shares more than 85% amino acid sequence similarity with two orthologs from An. gambiae and Aedes aegypti. However, adGSTE4-4 possesses greater catalytic efficiency (kcat/Km) for CDNB as well as greater activity for several other substrates. In addition, adGSTE4-4 enzyme possesses peroxidase activity while this activity was not observed for the An. gambiae enzyme and adGSTE4-4 enzyme also binds two pyrethroid insecticides (permethrin and λ–cyhalothrin) with relatively high affinity. Moreover, the Pro14Leu variant exhibited the lowest enzyme activities for all substrates tested and showed no inhibition with either permethrin or λ-cyhalothrin while Glu44Lys variant had similar kinetic properties to wild type enzyme except a decrease in half life whereas Ile131Thr variant had no detectable peroxidase activity and showed variation in substrate specificity and half life stability. In conclusion, that An. dirus GST Epsilon 4 enzyme, unlike the An. gambiae enzyme, can contribute to pyrethroid resistance by sequestration as well as protect against oxidation from secondary pyrethroid metabolites via its peroxidase activity. Furthermore, the Pro14 position of adGSTE4-4 appears to be an important residue that impacts on enzyme catalysis and pyrethroid binding affinities while substitution of Glu44 and Ile131 residues showed only small affect on the structural stability of the enzyme.

Abstract: เอนไซม์กลูตาไธโอน ทรานสเฟอเรส (GST) ของแมลงกำลังเป็นที่สนใจ เนื่องจากมีกลไกต่อการดื้อยา ฆ่าแมลงหลายประเภท เมื่อไม่นานมานี้มีการค้นพบกลุ่มของเอนไซม์ GST ชนิดเอพซิลอน ซึ่งจำเพาะเจาะจงต่อ แมลง และยังมีส่วนเกี่ยวข้องต่อการดื้อยาฆ่าแมลงในยุง Anopheles gambiae (An. gambiae) ดังนั้นวัตถุประสงค์ ของวิทยานิพนธ์เล่มนี้ จึงต้องการที่จะจัดจำแนกและศึกษาหน้าที่ของเอนไซม์ GST ชนิดเอพซิลอนตัวที่สี่ ชื่อว่า adGSTE4-4 รวมถึงเอนไซม์กลายพันธุ์ชนิดนี้ในยุง Anopheles dirus (An. dirus) ซึ่งเป็นพาหะของโรคมาเลเรียใน ประเทศไทย เพื่อที่จะนำมาเปรียบเทียบกับเอนไซม์ชนิดเดียวกัน ที่พบในยุง An. gambiae และ Aedes aegypti (Ae. aegypti) งานวิจัยนี้เริ่มจากการทำ RT-PCR เพื่อให้ได้ยีนสำหรับการสร้างเอนไซม์ adGSTE4-4 ตัวต้นแบบและ เอนไซม์กลายพันธุ์ 3 ชนิดคือ Pro14Leu, Glu44Lys, และ Ile131Thr หลังจากทำการยืนยันลำดับเบสแล้ว ยีน เหล่านี้จึงถูกโคลนเข้าไปในเวคเตอร์ชนิด pET3a เพื่อทำการแสดงออก จากนั้นจึงทำให้เอนไซม์บริสุทธิ์ก่อนนำมา ศึกษาคุณสมบัติในการเร่งปฏิกิริยาเคมี ความจำเพาะเจาะจงต่อซับสเตรต ความเสถียรของเอนไซม์ และการถูก ยับยั้งโดยสารจำพวกไพรีทรอยด์ จากผลการทดลองพบว่าเอนไซม์ adGSTE4-4 มีลำดับของกรดอะมิโนเหมือนกับ เอนไซม์ชนิดเดียวกันที่พบในยุง An. gambiae และ Ae. aegypti ประมาณ 85% อย่างไรก็ดีเอนไซม์ adGSTE4-4 นั้นมีประสิทธิภาพสูงที่สุดในการเร่งปฏิกิริยาเคมีต่อซับสเตรตชนิด CDNB และมีประสิทธิภาพสูงในการเร่ง ปฏิกิริยาเคมีต่อซับสเตรตอื่นๆ ทั้งยังมีความสามารถในการเกิดปฏิกิริยากับสารจำพวกเปอร์ออกไซด์ได้ ซึ่งไม่พบ คุณสมบัตินี้ในเอนไซม์ชนิดเดียวกันที่พบในยุง An. gambiae นอกจากนี้เอนไซม์ adGSTE4-4 ยังมีความสามารถ ในการจับกับยาฆ่าแมลงจำพวกไพรีทรอยด์ได้ดี จากการวิจัยพบว่าเอนไซม์กลายพันธุ์ชนิด Pro14Leu มี ประสิทธิภาพต่ำสุดในการเร่งปฏิกิริยาเคมีต่อซับสเตรตทุกชนิดที่ใช้ในการทดลอง อีกทั้งยังไม่สามารถจับกับยาฆ่า แมลงจำพวกไพรีทรอยด์ได้ ขณะที่เอนไซม์กลายพันธุ์ชนิด Glu44Lys มีคุณสมบัติเหมือนกับเอนไซม์ต้นแบบ ยกเว้นเสถียรภาพของเอนไซม์ที่ลดลง ส่วนเอนไซม์กลายพันธุ์ชนิด Ile131Thr นั้นไม่พบคุณสมบัติในการ เกิดปฏิกิริยากับสารจำพวกเปอร์ออกไซด์ และมีความจำเพาะเจาะจงต่อซับสเตรตรวมถึงเสถียรภาพของเอนไซม์ เปลี่ยนไป โดยสรุปเอนไซม์ adGSTE4-4 มีคุณสมบัติต่างไปจากเอนไซม์ชนิดเดียวกันที่พบในยุง An. gambiae เนื่องจากสามารถต้านทานยาฆ่าแมลงจำพวกไพรีทรอยด์ได้โดยการจับตัวกับยาฆ่าแมลง และยังมีคุณสมบัติในการ เกิดปฏิกิริยากับสารจำพวกเปอร์ออกไซด์ที่ได้มาจากกระบวนการทำลายสารไพรีทรอยด์ในกลไกอื่น ซึ่งช่วย ป้องกันการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารเปอร์ออกไซด์ได้ นอกจากนี้ โพรลีนตำแหน่งที่ 14 ยังมีบทบาทสำคัญ ต่อความสามารถในการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์รวมถึงการจับกับสารจำพวกไพรีทรอยด์ ในขณะที่การถูกแทนที่ ของ กลูทามิกตำแหน่งที่ 44 และ ทรีโอนีนตำแหน่งที่ 131 ส่งผลเล็กน้อยต่อเสถียรภาพทางโครงสร้างของเอนไซม์

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Ketterman Albert J

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2553-06-28

Issued: 2010-06-28

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH G973i 2006

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4538045.pdf	2.35 MB	23	2018-05-29 14:30:35

ใช้เวลา

-0.705241 วินาที