Study of NADPH-cytochrome p450 oxidoreductase from Anopheles minimus mosquito

การศึกษาเอนไซม์ NADPH-cytochrome p450 จากยุงก้นปล่องสายพันธุ์ Anopheles minimus.

Name: Songklod Sarapusit

MeSH: Anopheles

Othors: Flavins

MeSH: NADPH-Ferrihemoprotein Reductase

MeSH: Protein Stability

LCSH: Chemical kinetics

Abstract: NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase (CYPOR), a membrane-bound protein, contains both FAD and FMN cofactors, and functions as a shuttle to transfer two electrons, one at a time, from NADPH to various cytochromes P450s to fulfill their functions. In the present study, the membrane-bound flAnCYPOR and soluble Δ55AnCYPOR were heterologously expressed and purified to homogeneity and functionally active. The purified AnCYPOR enzymes showed characteristics spectroscopic spectra of CYPOR and possessed NADPH-dependent cytochrome c reduction activity. However, the purified AnCYPOR enzymes readily lost their flavin co-factors and were unstable as CYPORs of other organisms. The activity and stability of the enzymes, nevertheless, could be improved by supplementation of FAD and FMN cofactors. The results of kinetic studies revealed that the kinetic mechanism of AnCYPOR was ion dependent. At low ionic strength the AnCYPOR activity followed a random Bi-Bi mechanism, while the enzymes followed non-classical two-site Ping- Pong mechanism at high ionic strength. In order to understand the basis for the instability and to generate a more stable protein, three residues were chosen for mutagenesis studies, namely, residues L86, L219, and P456. These amino acids were selected based on the crystal structure of rat CYPOR and sequence alignment of CYPOR proteins from various organisms. Two substitutions in the FMN binding domain, L86F and L219F, were found to increase cofactors retention to their respective binding site. Such substitutions increased the stability of the enzymes with significant reduction in enzyme aggregation, compared to the wild-type enzyme. The P456A substitution in the FAD binding domain did not affect cofactor binding or enzyme stability. The mutant enzymes had kinetic mechanisms and substrate binding constants similar to the wild-type enzyme indicating that was no change in kinetic properties introduced by the mutations. A higher stability and higher turnover number in the mutant L86F/L219F flAnCYPOR enzyme illustrate a more efficient electron transfer of AnCYPOR to P450 compared to the wild-type flAnCYPOR enzyme, resulting in higher CYP6AA3-mediated activity

Abstract: เอนไซม์ NADPH-Cytochrome P450 Oxidoreductase (CYPOR) ทำหน้าที่สำคัญใน การส่งผ่านอิเล็คตรอนไปให้กับเอนไซม์อื่นๆ โดยเฉพาะเอนไซม์ Cytochrome P450 ในการย่อย สลายสารต่างๆ ในการศึกษานี้ CYPOR จากยุงก้นปล่อง (AnCYPOR) ทั้งในรูปที่มีส่วนจับกับ เยื่อหุ้ม (flAnCYPOR) และส่วนที่ปราศจากส่วนจับกับเยื่อหุ้ม (Δ55AnCYPOR)ได้ถูกนำมาเข้าสู่ กระบวนการทางพันธุวิศวกรรม จนสามารถทำให้เอนไซม์บริสุทธิ์ ทำให้ค้นพบว่าเอนไซม์มีการ สูญเสียการจับกับ FAD และ FMN cofactors และไม่เสถียรเมื่อเทียบกับ CYPOR จากสิ่งมีชีวิต อื่น อย่างไรก็ตามกิจกรรมการทำงานสามารถเพิ่มได้เมื่อมี FAD และ FMN เพิ่มในปฎิกิริยา ผล จากการศึกษาจลน์ศาสตร์ของเอนไซม์พบว่ากลไกการทำงานของ AnCYPOR นี้ขึ้นอยู่กับความ เข้มข้นของประจุในสารละลาย เพื่อศึกษาความไม่เสถียรของเอนไซม์นี้และเพื่อสร้างเอนไซม์ที่เสถียรมากขึ้น กรดอะมิโน สามตำแหน่งได้ทำการศึกษาโดยการแทนที่ด้วยกรดอะมิโนอื่น โดยแทนที่กรดอะมิโน leucine ที่ ตำแหน่ง 86 และ 219 ด้วย phenylalanine ในส่วน FMN domain และแทนที่กรดอะมิโน proline ด้วย alanine ในส่วน FAD domain โดยพบว่าการแทนที่ในบริเวณ FMN domain ทำ ให้เอนไซม์จับกับ flavin co-factors ดีขึ้น เสถียรมากขึ้น และมีค่ากิจกรรมทางเอนไซม์ที่เพิ่มขึ้น และสามารถเพิ่มการทำงานของเอนไซม์ CYP6AA3 จากยุงก้นปล่องในการย่อยสลายยาฆ่าแมลง ได้ดีขึ้น ผลที่ได้แสดงให้เห็นว่ากรดอะมิโนที่เป็นปัญหานี้ (leu86 และ leu219) มีบทบาทที่สำคัญ ยิ่งต่อการทำงานของเอนไซม์

Mahidol University

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Pornpimol Rongnoparut

Role: Thesis Advisors

Created: 2009

Modified: 2553-06-21

Issued: 2010-06-21

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH S698s 2009

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Biochemistry

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4436741.pdf	4.67 MB	56	2018-05-29 14:20:48

ใช้เวลา

-0.761528 วินาที