The development of loop-mediated isothermal amplification with lateral-flow dipsticks (LAMP-LFD) to detect infection of Hepatopancreatic parvovirus (HPV)

การพัฒนาเทคนิค loop-mediated isothermal amplification ร่วมกับเทคนิค lateral-flow dipsticks (LAMP-LFD) เพื่อการศึกษาการมีอยู่ของเชื้อไวรัส Hepatopancreatic parvovirus (HPV) ที่เป็นสาเหตุของโรคกุ้งแคระ

Name: Tongchai Nimitphak

MeSH: Molecular Diagnostic Techniques

LCSH: Hepatopancreatic parvovirus

LCSH: Shrimps -- Virus diseases

Abstract: Shrimp hepatopancreatic parvovirus (HPV) is a DNA virus that retards growth in cultivated shrimp. Present methods for its detection include normal or nested PCR followed by electophoresis, PCR-ELISA, real-time PCR, immunodetection and histological examination. These techniques entail various disadvantages such as high cost, long assay time or use of toxic substances. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is a novel method for rapid, sensitive and specific pathogen detection via amplification of target nucleotide sequences under inexpensive isothermal conditions. Combining LAMP with amplicon detection by chromatographic lateral-flow dipsticks (LFD) instead of electrophoresis allows interpretation of results within 10 min. A set of four LAMP primers was designed from the capsid protein gene of HPV and LAMP conditions were optimized at 63oC for 1 h. The FITC-labeled DNA probe for the LFD test was optimized at 20 pmole. With a quantified plasmid template containing the LAMP target sequence, LAMPLFD was 100 times more sensitive than PCR-electrophoresis and equal to nested PCRelectrophoresis. With DNA extracts from HPV-infected shrimp, it was 10 times more sensitive than normal PCR-electrophoresis but 10 times less sensitive than a commercial kit for nested PCR-electroporesis. The LAMP-LFD method gave negative test results with DNA extracts from normal shrimp and from shrimp infected with other DNA viruses including monodon baculovirus (MBV), white spot syndrome virus (WSSV) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV).

Abstract: Hepatopancreatic parvovirus หรือ HPV เป็นไวรัสที่มีสารพันธุกรรมเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยว ที่เป็นสาเหตุของโรคกุ้งแคระ ในปัจจุบันมีวิธีตรวจสอบไวรัสชนิดนี้หลายวิธี ได้แก่ PCR หรือ nested PCR ที่ตามด้วยการตรวจสอบผลโดยการแยกด้วยกระแสไฟฟ้าบนแผ่นเจลอะกาโรส เทคนิค PCR-ELISA เทคนิค real-time PCR เทคนิคการตรวจสอบทางภูมิคุ้มกัน และเทคนิคทางพยาธิวิทยา ของเนื้อเยื่อ ซึ่งเทคนิคเหล่านี้ล้วนมีข้อเสีย เช่น ราคาแพง ใช้เวลาในการตรวจนาน หรือใช้สารก่อ พิษ เทคนิค Loop-mediated isothermal amplification หรือ LAMP เป็นเทคนิคใหม่ที่รวดเร็ว ราคาถูก มีความไว และ ความจำเพาะสูงในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมภายใต้สภาวะอุณหภูมิเดียว การ รวมเทคนิค LAMP กับเทคนิค lateral-flow dipsticks หรือ LAMP-LFD เป็นการตรวจสอบผลผลิต LAMP โดยอาศัยหลักการของเทคนิคโครโมโตกราฟฟีแทนการแยกด้วยกระแสไฟฟ้า ทำให้สามารถ วิเคราะห์ผลได้ภายในเวลาเพียง 10 นาที การศึกษาเริ่มจากการออกแบบไพรเมอร์สำหรับปฏิกิริยา LAMP 4 ตัว จากส่วนของโปรตีน capsid ของไวรัส HPV ซึ่งสภาวะของปฏิกิริยา LAMP ที่ เหมาะสมคืออุณหภูมิ 63oC เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ผลผลิต LAMP ที่ได้ถูกตรวจสอบด้วยเทคนิค LFD โดยการเติม DNA ติดตามที่เชื่อมติดกับ FITC ปริมาณ 20 pmole เมื่อทดสอบความไวในการตรวจ ด้วยเทคนิค LAMP-LFD โดยใช้พลาสมิดซึ่งมีลำดับเบสเป้าหมายที่ทราบจำนวนพบว่าเทคนิคนี้มี ความไวมากกว่าเทคนิค PCR 100 เท่า ซึ่งเทียบเท่ากับเทคนิค nested-PCR อย่างไรก็ตามเมื่อ ตรวจสอบกับ DNA ของตับกุ้งที่ติดเชื้อไวรัส HPV พบว่า LAMP-LFD มีความไวมากกว่า PCR 10 เท่า แต่น้อยกว่าชุดตรวจ nested-PCR 10 เท่า นอกจากนั้น LAMP-LFD ได้ให้ผลลบต่อ DNA ที่สกัด จากกุ้งปกติ และกุ้งที่ติดเชื้อไวรัสชนิดอื่นๆ เช่น monodon baculovirus หรือ MBV ไวรัสตัวแดงดวง ขาว หรือ WSSV และ ไวรัส infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus หรือ IHHNV

Mahidol University

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Flegel Timothy William

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2553-06-21

Issued: 2010-06-21

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH T665d 2008

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Biotechnology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4837145.pdf	2.69 MB	55	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.407295 วินาที