Characterisation of residues stabilising [beta]2-[beta]3 and [beta]4-[beta]5 hairpins critical for toxicity of the bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin

การศึกษาคุณลักษณะของกรดอะมิโนที่เกี่ยวข้องกับเสถียรภาพโครงสร้างของ B2-B3 และ B4-B5 hairpins ซึ่งมีความสำคัญต่อความเป็นพิษของโปรตีน Cry4Ba.

Name: Benyapat Puripunpinyo

LCSH: Aromaticity (Chemistry)

MeSH: Bacillus thuringiensis

MeSH: Hydrophobicity

Abstract: The aim of this study was to study the structure-function relationship of a ring amino acid cluster in the core of domain II of the Bacillus thuringiensis Cry4Ba toxin. PCR-based mutagenesis was performed to investigate the role of Phe326 in β2 and His370 in β5 of the Cry4Ba toxin. Replacement of Phe326 with aliphatic hydrophobic (alanine and leucine) or aromatic (tyrosine and tryptophan) side chains and His370 with alanine were initially performed. All mutants were able to overexpress the 130-kDa protoxin as an inclusion body in Escherichia coli upon IPTG at a level comparable to the wild type. Similar to the wild type, E. coli cells expressing mutant protoxins were toxic to Aedes aegypti mosquito larvae. Further replacements were performed with polar uncharged (glutamine), positively or negatively charged (arginine or glutamine) side chains for Phe326, and leucine for His370. Only E. coli cells expressing charge replacement mutants almost abolished larvicidal activity. The data suggest that hydrophobicity at Phe326 was essential for the larvicidal activity of Cry4Ba, possibly participating in hydrophobic interaction with surrounding residues inside the core of domain II of Cry4Ba structure, stabilizing β2- β3 and β4-β5 hairpins that are critical for Cry4Ba toxicity. The hydrophobicity of His370 plays a smaller role in the Cry4Ba toxicity than Phe326.

Abstract: การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างและหน้าที่ของกรดอะมิโน ชนิดวงแหวนที่จับกันเป็นกลุ่ม (cluster) ในส่วนของ domain II ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง Cry4Ba เทคนิค PCR ได้ถูกนำมาใช้ในการเปลี่ยนแปลงยีนเฉพาะที่ (site-directed mutagenesis) ณ ตำแหน่ง Phe326 ใน β2 และ His370 ใน β5, Phe326 ถูกแทนที่ด้วยกรดอะมิโนแบบ aliphatic ขนาดเล็กและใหญ่ (alanine และ leucine ตามลำดับ) กรดอะมิโนวงแหวนที่มีขั้วและที่มีขนาดใหญ่ (tyrosine และ tryptophan ตามลำดับ) ส่วน His370 ถูกแทนที่ด้วย alanine เมื่อทดสอบความเป็นพิษของโปรตีนกลายพันธุ์ดังกล่าว พบว่า โปรตีนกลายพันธุ์ทุกชนิดยังคงความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงเสมือนกับโปรตีนต้นแบบ (wild type) นอกจากนี้เมื่อได้ทำการศึกษาเพิ่มเติมโดยการแทนที่ทั้ง Phe326 และ His370 ด้วยกรดอะมิโนแบบมีขั้วแต่ ไม่มีประจุ (glutamine) และด้วยกรดอะมิโนที่มีประจุบวกและประจุลบ (arginine และ glutamate ตามลำดับ) รวมถึงการแทนที่ His370 ด้วยกรดอะมิโนแบบ aliphatic ขนาดใหญ่ (leucine) ซึ่งเมื่อนำ โปรตีนกลายพันธุ์มาทดสอบความเป็นพิษต่อลูกน้ำยุงพบว่า เฉพาะการแทนที่ Phe326 ด้วย arginine และ glutamate นั้นทำให้โปรตีนฆ่าลูกน้ำยุง Cry4Ba สูญเสียความเป็นพิษจนเกือบหมด จากผลการศึกษานี้จึง เสนอว่า คุณสมบัติของความเป็น hydrophobic ของ Phe326 มีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการออกฤทธิ์ฆ่า ลูกน้ำยุงของโปรตีน Cry4Ba โดยอาจมีส่วนร่วมต่อการสร้างแรงยึดเหนี่ยวแบบ hydrophobic ระหว่าง ตำแหน่ง 326 นี้กับกรดอะมิโนแวดล้อมอื่นๆที่อยู่ด้านในโครงสร้างเพื่อคงโครงสร้างของ β2-β3 และ β4-β5 hairpins ของ domain II ในขณะที่ ความเป็น hydrophobic ของ His370 แสดงความสำคัญต่อ ความเป็นพิษของโปรตีน Cry4Ba น้อยกว่า เมื่อเทียบกับ Phe326

Mahidol University

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Chanan Angsuthanasombat

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2553-06-21

Issued: 2010-06-18

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH B479c 2008

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4937173.pdf	7.26 MB	6	2020-04-30 19:42:53

ใช้เวลา

0.276389 วินาที