The CFTR-Based high-throughput screening assay for GPCR modulators

การคัดกรองหาสารปรับการทำงานของรีเซพเตอร์ที่จับกับจีโปรตีนโดยอาศัยซีเอฟทีอาร์โปรตีน

Name: Buranee Yangthara

MeSH: Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

MeSH: Receptors CCR10

MeSH: Receptors Vasopressin

Abstract: G-protein coupled receptors (GPCRs) such as the vasopressin-2 receptor (V2R) are an important class of drug targets. An efficient high-throughput screening assay was developed for GPCR-induced cAMP elevation using as read-out cAMP activation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) Clchannels. Fischer rat thyroid cells expressing CFTR and a halide-sensing yellow fluorescent protein (YFP-H148Q/I152L) were transfected with V2R. Increased cell Cl- conductance following agonist-induced cAMP elevation was assayed using a platereader from the cell fluorescence following solution I- addition. The Z’-factor for the assay was ~0.7 with the V2R agonist dDAVP (1 nM) as positive control. Primary screening of 50,000 small molecules yielded novel classes of 5-aryl-4- benzoyl-3-hydroxy-1-(2-arylethyl)-2H-pyrrol-2-one (V2Rinh class), a V2R antagonist, and 2-(acylamino)-3-thiophenecarboxylates (PDEact class), a possible phosphodiesterase activator. The most potent compounds in the V2Rinh class, V2Rinh-02, fully displaced the radiolabeled vasopressin in binding experiments with the IC50 of ~70 nM. Through reduction of the cAMP level, the PDEact inhibited not only the dDAVP-, but also cholera toxin-, forskolin-, and dibutylryl cAMP-induced transepithelial currents. Therefore, activation of phosphodiesterase was a suggested mechanism action. The in vitro properties of the V2Rinh and PDEact suggested their potential utility in aquaretic applications, and in conditions with pathologic elevation of cyclic nucleotide levels, respectively.

Abstract: รีเซพเตอร์ที่จับกับจีโปรตีนเช่น เวโซเพรซซิน 2 รีเซพเตอร์ เป็นเป้าหมายที่สำคัญในการผลิตยา วิธีการคัดกรองหาสารปรับการทำงานของ รีเซพเตอร์ดังกล่าวได้รับการพัฒนาขึ้นในเซลล์ต่อม ไทรอยด์ของหนูฟิชเชอร์ที่มี ซีเอฟทีอาร์ เวโซเพรซซิน 2 รีเซพเตอร์ และ โปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (เป็นตัววัดคลอไรด์) โดยวัดปริมาณไซคลิกเอเอ็มพีที่เพิ่มขึ้นหลังการกระตุ้นรีเซพเตอร์ซึ่งจะไปมีผล เพิ่มความสามารถในการนำคลอไรด์ผ่าน ซีเอฟทีอาร์(ช่องทางผ่านของคลอไรด์) วิธีคัดกรองนี้ให้ค่า ซีไพรมเฟคเตอร์ 0.71 ซึ่งเข้าเกณฑ์การคัดกรองที่ได้มาตรฐานดีมาก การใช้การคัดกรองแบบใหม่นี้ กับสารเคมีโมเลกุลเล็กจำนวน 50,000 โมเลกุลพบโมเลกุล 2 ชนิดซึ่งมีฤทธิ์เป็นเวโซเพรซซิน 2 รี เซพเตอร์แอนทาโกนิส (5-aryl-4-benzoyl-3-hydroxy-1-(2-arylethyl)-2H-pyrrol-2-one หรือ V2Rinh) และ สารที่อาจเป็นตัวกระตุ้นฟอสฟอไดเอสเตอเรสหรือเอนไซม์ที่สลายไซคลิกเอเอ็มพี (2- (acylamino)-3-thiophenecarboxylates หรือ PDEact) ตามลำดับ V2Rinh ตัวที่ดีที่สุดสามารถ แทนที่เวโซเพรซซินกัมมันตภาพรังสีได้ 50% ที่ความเข้มข้น 70nM ในขณะที่ PDEact ยับยั้ง กระแสไฟฟ้าข้ามเซลล์ และ การเพิ่มขึ้นของไซคลิกเอเอ็มพีที่เกิดจาก ดีดีเอวีพี ฟอสโคลิน และ พิษ คอเลราได้ รวมทั้งยังยั้งกระแสไฟฟ้าข้ามเซลล์จากไดบิวไทริวไซคลิกเอเอ็มพีได้ ดังนั้นกลไกการ ออกฤทธิ์ที่เป็นไปได้มากที่สุดจึงน่าจะเป็นการกระตุ้นฟอสโฟไดเอสเตอเรส คุณสมบัติของสารเคมี ทั้งสองชนิดดังกล่าวสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการขับน้ำออกจากร่างกาย และใช้ในโรคหรือ สภาวะที่มีการเพิ่มขึ้นอย่างผิดปรกติของไซคลิกเอเอ็มพี

Mahidol University

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Varanuj Chatsudthipong

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2553-06-17

Issued: 2010-06-17

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH B945C 2008

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Physiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4537109.pdf	3.51 MB	39	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.253693 วินาที