Molecular cloning and characterization of a cDNA encoding argonaute protein from Penaeus monodon

การโคลนและการศึกษาหน้าที่ของ cDNA ที่สร้างโปรตีน Argonaute ในกุ้งกุลาดำ

Name: Manasave Dechklar

LCSH: Cloning Molecular

LCSH: DNA Complementary

LCSH: RNA Double-Stranded

LCSH: Argonaute protein

LCSH: Penaeus monodon

Abstract: Argonaute proteins are present in diverse organisms ranging from yeast to humans. In addition to their role in developmental control, some Argonautes have been shown to play essential roles in a variety of post-transcriptional RNA-mediated gene silencing pathways, including RNA interference or RNAi mediated by sequencespecific double-stranded RNA. This work is aimed at the characterization of an Argonaute that associates with RNAi in the shrimp Penaeus monodon in order to provide an in-depth understanding of the RNA-mediated gene silencing mechanism in the shrimp. A total of 2,829 bp of the cDNA encoding Argonaute of P. monodon (Pem-AGO) was obtained from RT-PCR and RACE methods, using mRNA from the lymphoid (Oka) organ as a template. The deduced amino acid sequence of Pem-AGO contained the two conserved domains, PAZ and PIWI, which are the signature of the Argonaute family. The requirement for Pem-AGO in RNAi was explored in the primary Oka cell culture of P. monodon. Transfection with three dsRNAs corresponding to different regions in the Pem-AGO sequence resulted in approximately 30% reduction of Pem-AGO expression in the Oka cells. The subsequent effect of the depletion in Pem-AGO mRNA level on the efficacy of RNAi was determined by the amount of silencing in the endogenous 5-HT receptor gene by its specific dsRNA. Pem-AGO depletion led to impaired RNAi as demonstrated by partial restoration of 5-HT receptor gene expression in the cells that acquired dsRNAs, which target both the Pem-AGO and 5-HT receptor genes. By contrast, only slight or no impairment of RNAi was seen when the exogenous gene, the protease gene of yellow head virus, was targeted for silencing in Pem-AGO depleted cells. In summary, the results from this study suggest the involvement of Pem-AGO in RNA-mediated gene silencing by RNAi mechanism in P. monodon

Abstract: Argonaute เป็นโปรตีนที่พบในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด โปรตีนชนิดนี้ทำหน้าที่หลากหลายทั้งใน กระบวนการเจริญเติบโตและในกระบวนการยับยั้งการแสดงออกของยีนด้วยอาร์เอ็นเอสายคู่ ที่เรียกว่า RNA interference (RNAi) การศึกษาวิจัยนี้เป็นการโคลนยีน Argonaute ของกุ้งกุลาดำ โดยใช้อาร์เอ็น เอซึ่งสกัดจากต่อมน้ำเหลืองของกุ้งกุลาดำในการสังเคราะห์ชิ้น cDNA ด้วยปฎิกิริยา RT-PCR ซึ่งใช้ไพร์ เมอร์ที่ถูกออกแบบจากลำดับของกรดอะมิโนของโปรตีนชนิดนี้ซึ่งมีความคล้ายคลึงกันในสิ่งมีชีวิตชนิด อื่นๆ ชิ้นของ cDNA ที่สร้างโปรตีน Argonaute ของกุ้งกุลาดำ (Pem-AGO) มีขนาด 2,829 นิวคลีโอ ไทด์ และลำดับของกรดอะมิโนที่ถอดรหัสจากลำดับนิวคลีโอไทด์ประกอบด้วยลักษณะสำคัญของโปรตีน Argonaute ได้แก่ส่วนอนุรักษ์ที่เรียกว่า PAZ และ PIWI domain การศึกษาหน้าที่ของโปรตีนชนิดนี้ใน กระบวนการ RNAi ได้ใช้วิธีการนำอาร์เอ็นเอสายคู่ที่สังเคราะห์จากลำดับนิวคลีโอไทด์ของ Argonaute เข้าสู่เซลล์ปฐมภูมิจากต่อมน้ำเหลืองของกุ้งกุลาดำ จากการทดลองพบว่าอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อ Argonaute มีผลทำให้มีการแสดงออกของ Argonaute ในเซลล์ลดลงประมาณ 30% การศึกษาผลกระทบ ของระดับ Argonaute ในเซลล์ ต่อกระบวนการ RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของยีนในกุ้งกุลาดำ พบว่าอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะต่อตัวตอบรับซีโรโตนินสามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนสร้างตัวตอบรับ ซีโรโตนินได้ในเซลล์ที่มี Argonaute ในระดับปรกติ ในทางตรงกันข้ามอาร์เอ็นเอสายคู่ของตัวตอบรับซี โรโตนินไม่สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนเป้าหมายได้เมื่อระดับของArgonaute ลดลง อย่างไรก็ตาม การศึกษาทำนองเดียวกันนี้กับยีนที่สร้างโปรตีนของไวรัสหัวเหลือง ไม่เห็นผลที่ชัดเจนของระดับของ Argonaute ในเซลล์ต่อการยับยั้งการแสดงออกของยีนไวรัสหัวเหลืองด้วยอาร์เอ็นเอสายคู่ที่จำเพาะ กล่าว โดยสรุปยีนที่สร้าง Argonaute ที่ศึกษาในงานวิจัยนี้ มีความสำคัญต่อกระบวนการยับยั้งการแสดงออก ของยีนด้วยอาร์เอ็นเอสายคู่หรือ RNAi ในเซลล์ของกุ้งกุลาดำ

Mahidol University

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Apinunt Udomkit

Role: Thesis Advisors

Created: 2006

Modified: 2010-06-19

Issued: 2010-06-15

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH M267m 2006

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Molecular Genetics and Genetic Engineering

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636878.pdf	1.5 MB	49	2018-05-29 13:13:39

ใช้เวลา

-0.69273 วินาที