Analyses of potential virulence genes uniquely identified in the genome of Burkholderia Pseudomallei

การศึกษายีนที่มีผลต่อความรุนแรงของโรคจากข้อมูลยีโนมของเชื้อ Burkholderia Pseudomallei.

Name: Metawee Thongdee

LCSH: Burkholderia pseudomallei

LCSH: Genome

LCSH: Melioidosis

Abstract: Burkholderia pseudomallei, a saprophytic Gram-negative bacillus is the causative agent of melioidosis. The mechanisms contributing to B. pseudomallei virulence need to be elucidated to understand the pathogenicity of this organism. Genomic comparison by subtractive hybridization was performed between virulent B. pseudomallei and the closely related nonvirulent B. thailandensis to identify potential virulence genes unique to B. pseudomallei. DNAs of both species were hybridized and the hybrid sequences were then removed. Consequently, the remaining unhybridized DNAs represented genes that were present in B. pseudomallei but were absent from B. thailandensis. The products of the subtractive hybridization were used to construct a subtracted library of B. pseudomallei. Eighty-six individual clones were generated in the subtracted library; the majority was specific to B. pseudomallei. A majority of these clones were mapped to genes within genomic islands or island-like regions, although almost half of these clones represented hypothetical genes with unknown functions. The remaining clones represented genes whose products were proteins with known functions including proteins involved in virulence such as proteins for capsule production, proteins of type III secretion system, exoproteins, adhesins and fimbriae. These unique genes are likely to play an important role in the development of B. pseudomallei virulence. To understand their role in the pathogenicity of B. pseudomallei, a novel procedure was developed for generating deletion mutations by natural transformation in B. pseudomallei and also B. thailandensis. The procedure utilized fragments carrying selectable markers flanked by regions of homology oriented such that homologous recombination replaced genomic sequences with the selectable marker. Deletion mutants were confirmed for the presence of the appropriate insertion and loss of the targeted wild type sequences by PCR. This procedure was also applied to transfer chromosomal DNA for generating deletion mutations in both species. The antibiotic resistance marker used for mutant selection can be removed from the genome by site-specific excision allowing reutilization of the marker for genetic selection and phenotype examination without marker effects. Moreover, the donor DNA, in the form of either PCR fragment or chromosomal DNA, can be transferred within the same species and between B. pseudomallei and B. thailandensis. These procedures for creating targeted gene knock-out mutations and moving them between strains should facilitate genetic analysis of virulence genes including those identified in the subtractive hybridization studies.

Abstract: Burkholderia pseudomallei เป็นเชื้อแบคทีเรียกรัมลบ รูปแท่ง พบในดิน ซึ่งเชื้อนี้เป็นสาเหตุของโรคเมลิออยโดสิส ความสามารถในการพัฒนาความรุนแรงของเชื้อนี้ยังคงต้องการการศึกษาเพื่อทำความเข้าใจกลไกการก่อโรค ในการศึกษานี้ได้ทำการเปรียบเทียบ สารพันธุกรรมของเชื้อ B. pseudomallei สายพันธุ์ที่ก่อโรคกับเชื้อ B. thailandensis สายพันธุ์ที่ไม่ก่อโรคโดยวิธี subtractive hybridization โดยสารพันธุกรรมของเชื้อทั้งสองที่มีความเหมือนกันจะถูกคัดออกให้เหลือแต่สารพันธุกรรมที่พบเฉพาะในเชื้อ B. pseudomallei และไม่พบในเชื้อ B. thailandensis สารพันธุกรรมที่ได้จะนำไปสร้างเป็น subtracted library ของเชื้อ B. pseudomallei subtracted library ที่ได้มีโคลนที่มีสารพันธุกรรมของเชื้อ B. pseudomallei ที่แตกต่างกันจำนวน 86 ชิ้น และชิ้นของสารพันธุกรรมดังกล่าวส่วนใหญ่มีความจำเพาะกับเชื้อ B. pseudomallei ชิ้นของสารพันธุกรรมส่วนใหญ่ตรงกับยีนที่อยู่ใน บริเวณของ genomic islands or genomic islands-like ของยีโนม ซึ่งเกือบครึ่งเป็นยีนของโปรตีนที่ไม่ทราบหน้าที่ และส่วนที่ เหลือเป็นยีนของโปรตีนที่ทราบหน้าที่โดยเฉพาะโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการความรุนแรงของเชื้อได้แก่ โปรตีนสำหรับการสร้างแคปซูล, โปรตีน ของ type III secretion system, exoprotein, adhesin และ fimbriae ทั้งนี้ยีนที่จำเพาะดังกล่าวน่าจะมีส่วนสำคัญในการ พัฒนาความรุนแรงของเชื้อ B. pseudomallei การศึกษาหน้าที่การทำงานของยีนที่น่าจะมีส่วนเกี่ยวข้องกับความรุนแรงของเชื้อ B. pseudomallei จะช่วยให้เกิดความเข้าใจ ในการก่อโรคเมลิออยโดสิส และเพื่อประโยชน์ของการศึกษาดังกล่าว จึงได้มีการพัฒนาเทคนิคเพื่อทำให้ยีนที่สนใจของเชื้อ B. pseudomallei และ B. thailandensis สูญเสียการทำงานโดยอาศัย natural transformation ของชิ้น PCR โดยชิ้น PCR ดังกล่าวประกอบด้วย ยีนของยาปฏิชีวนะที่ใช้เป็นตัวคัดเลือกโคลนที่มีการสูญเสียยีนที่สนใจขนาบด้วยชิ้นของสารพันธุกรรมที่เป็น บริเวณส่วนต่อของยีนที่สนใจ หลังจากชิ้น PCR ถูกนำเข้าสู่เชื้อ B. pseudomallei และ B. thailandensis แล้ว ชิ้น PCR ดังกล่าวจะแทรกเข้าสู่ยีโนมของ Burkholderia โดยจะแทนที่ยีนที่สนใจด้วยยีนของยาปฏิชีวนะ ทำให้เกิดการกลายพันธุ์และสูญเสียการ ทำงานของยีนที่สนใจ ซึ่งเชื้อที่ถูกทำให้กลายพันธุ์จะได้รับการยืนยันการสูญเสียยีนที่สนใจซึ่งถูกแทนที่ด้วยยีนของยาปฏิชีวนะด้วยเทคนิค PCR นอกจากนี้ยังพบว่าโครโมโซมของเชื้อที่กลายพันธุ์สามารถใช้เพื่อถ่ายทอดการกลายพันธุ์ระหว่างสายพันธุ์ได้ด้วยเทคนิคข้างต้น เนื่องจาก เทคนิคนี้ใช้ยีนของยาปฏิชีวนะเพื่อแทนที่ยีนที่สนใจและเพื่อคัดเลือกเชื้อที่มีการกลายพันธุ์ อย่างไรก็ตามยีนของยาปฏิชีวนะดังกล่าวสามารถถูก ตัดออกจากยีโนมโดยใช้เอนไซม์ที่จำเพาะ ซึ่งจะเป็นประโยชน์ในการนำยีนของยาปฏิชีวนะดังกล่าวกลับมาใช้ได้อีกและสามารถศึกษาผลที่เกิด จากการสูญเสียยีนที่สนใจโดยปราศจากผลกระทบที่อาจเกิดจากยีนของยาปฏิชีวนะที่แทรกอยู่ในยีโนมได้ นอกจากนี้เทคนิคดังกล่าวยังสามารถ ถ่ายทอดการกลายพันธุ์ในสายพันธุ์เดียวกันหรือระหว่างเชื้อ B. pseudomallei และ B. thailandensis โดยการใช้ชิ้น PCR หรือ โครโมโซม ทั้งนี้เทคนิคที่พัฒนาได้ดังกล่าวน่าจะช่วยในการศึกษาวิเคราะห์ยีนที่เกี่ยวข้องกับการก่อโรครวมทั้งยีนที่จำเพาะกับเชื้อ B. pseudomallei ที่ได้จากการทำ subtractive hybridization ข้างต้น

Mahidol University

Address: NAKHONPATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Tararaj Dharakul

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2553-06-21

Issued: 2010-06-14

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH M587a 2008

eng

DegreeName: Doctor of Philosophy

Level: Doctoral Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4338104.pdf	3.44 MB	9	2021-07-03 16:52:28

ใช้เวลา

-0.701034 วินาที