Production and screening of hybridoma clones producing monoclonal antibodies specific to dengue virus proteins

การผลิตและคัดกรองไฮบริโดมาที่ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี่

Name: Kroong Yoosook

MeSH: Antibodies Monoclonal

MeSH: Dengue Virus

MeSH: Hybridomas

MeSH: Viral Nonstructural Proteins

Abstract: Monoclonal antibodies (Mabs) specific to dengue proteins are one of the most effective tools to elucidate dengue pathogenesis as well as to diagnosis application. This study is aimed to generate hybridoma clones producing Mabs to dengue serotype- 1 (dengue-1) proteins, as a representative among four serotypes. Dengue-1 infected culture supernatant containing dengue particles as well as secreted NS1 protein was used as an immunogen for mouse immunization. Two BALB/c mice, namely M1 and M2, were injected with different dosages of dengue-1 at 2 weeks interval. Antibody responses in the sera of both immunized mice were detected. Fusions of mouse myeloma and spleen cells from each mouse were performed. The dengue-1 lysate coated ELISA and dot enzyme immunoassays (DEIA) were used for screening of positive hybridoma clones. In the fusion screening step, 7 out of 179 hybridoma supernatants gave positive reactivity by either or both assays. All positive fusion hybridomas were subjected to single cell cloning by limiting dilution. The monoclones were obtained from M1-84, M1-69 and M2-35 after the first limiting dilution step, while those from M1-53 were obtained after the second limiting dilution. Using Western blot analysis, only M1-53 and M1-84 limiting clone showed clear reactivity to dengue NS1 protein, while M1-69 and M2-35 gave a ladder of non-identified reactive bands to dengue proteins, which were excluded from the following studies. Mab 53A-1 and 84A, which were generated by monoclone M1-53 and M1-84, respectively, were further characterized. Both 53A-1 and 84A Mabs were IgG1 isotypes, reactive to NS1 protein of dengue-1 and recognize conformational epitope on NS1 protein. Application of both Mabs to NS1 capture ELISA indicated that they could differentiate dengue-1 from other serotypes. The immunization and screening protocols in this study could be applied to generate more Mabs to dengue proteins, especially NS1, which are specific to other serotypes. Those generated Mabs would be applicable to the development of a novel ELISA dengue NS1 serotyping

Abstract: โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ เป็นเครื่องมือที่สำคัญในการศึกษาพยาธิสภาพของ โรค และการพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยโรคไข้เลือดออก การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์ในการผลิตเซลล์ไฮบริโดมาที่ สามารถสร้างโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะกับโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ โดยเลือกซีโรทัยป์ 1 เป็นตัวแทนใน การศึกษา โดยใช้ไวรัสเด็งกี่และโปรตีน NS1 จากน้ำเลี้ยงเซลล์ที่มีการติดเชื้อไวรัสซีโรทัยป์ 1 ในการฉีดหนู BALB/c 2 ตัวคือ M1 และ M2 ด้วยปริมาณที่แตกต่างกันทุกๆ 2 สัปดาห์ เมื่อตรวจพบปริมาณแอนติบอดีต่อ ไวรัสเด็งกี่ในซีรั่มหนูทั้งสองตัว ได้ทำการเชื่อมเซลล์ม้ามของหนูแต่ละตัวกับเซลล์มะเร็งไมอิโลมาเพื่อสร้างเป็น เซลล์ไฮบริโดมา และทำการคัดเลือกโคลนที่มีการสร้างแอนติบอดีต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ด้วยวิธี ELISA หรือ DEIA จากไฮบริโดมาทั้งหมดที่ได้จากการเชื่อมเซลล์จำนวน 179 โคลน พบว่ามีเพียงจำนวน 7 โคลนเท่านั้นที่ สร้างแอนติบอดีต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ และถูกนำมาโคลนให้กลายเป็นเซลล์เดี่ยวโดยวิธี limiting dilution โดย ได้โคลนที่มาจากการทำครั้งที่หนึ่งจำนวน 3 โคลน ได้แก่ M1-69, M1-84 และ M2-35 ส่วนโคลน M1-53 นั้นได้มา หลังจากนำไปโคลนเป็นเซลล์เดี่ยวซ้ำเป็นครั้งที่สอง จากการศึกษาคุณสมบัติของแต่ละโคลนด้วยวิธี Western blot พบว่าโคลน M1-53 และ M1-84 ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะกับโปรตีน NS1 ของไวรัสเด็งกี่ ส่วนโม โนโคลนอลแอนติบอดีจากโคลน M1-69 และ M2-35 นั้นทำปฏิกิริยากับโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ที่ไม่ทราบชนิด จึง ไม่ได้นำมาศึกษาต่อ ผลการตรวจสอบคุณสมบัติของโมโนโคลนอลแอนติบอดี 53A-1 และ 84A ซึ่งได้มาจาก โคลน M1-53 และโคลน M1-84 ตามลำดับ พบว่าแอนติบอดีทั้งสองมี isotype เป็นชนิด IgG1 มีความจำเพาะต่อ โปรตีน NS1 ของไวรัสเด็งกี่ซีโรทัยป์ 1 และทำปฏิกิริยากับ conformational epitope ของ NS1 เท่านั้น จากการนำ โมโนโคลนอลแอนติบอดีทั้งสองมาประยุกต์ใช้ใน NS1 capture ELISA พบว่าสามารถแยกโปรตีน NS1 ของ ไวรัสเด็งกี่ซีโรทัยป์ 1 จากซีโรทัยป์อื่นๆได้อย่างจำเพาะ ผลที่ได้จากการศึกษานี้สามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการ ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ โดยเฉพาะโปรตีน NS1 ของเด็งกี่ซีโรทัยป์อื่นๆ ได้ ซึ่งอาจนำไปใช้ในการพัฒนาชุดตรวจโปรตีน NS1 ที่สามารถแยกซีโรทัยป์ของไวรัสเด็งกี่ได้ในอนาคต

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Panisadee Avirutnan

Role: Thesis Advisors

Created: 2008

Modified: 2553-06-22

Issued: 2010-06-12

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH K93p 2008

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Immunology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4636420.pdf	1.66 MB	8	2018-05-29 12:45:18

ใช้เวลา

0.272205 วินาที