Rapid detection of pathogenic leptospira in serum samples by duplex-PCR and hybridization using two synthetic DNA probes

การตรวจหาเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคอย่างรวดเร็วในตัวอย่างซีรัมด้วยวิธีดูเพล็ก-พีซีอาร์และการไฮบริไดเซชันด้วยโพรบที่สังเคราะห์ 2 ชนิด

Name: Suppalak Yesaeng

MeSH: DNA Probes

MeSH: Genes, rRNA

MeSH: Hybridization

MeSH: Leptospira

Abstract: Leptospirosis is recognized as one of the major health problems in Thailand. A rapid, sensitive, specific and reliable detection method for leptospirosis has become essential for effective therapy of the patient. In this study, a duplex- polymerase chain reaction (PCR) and hybridization based method for the rapid and specific detection of pathogenic leptospires in spiked normal serum samples was developed. Conditions for extraction of target bacterial DNA, amplification and hybridization were optimized to increase the sensitivity and specificity of the tests. The developed method included extraction of bacterial DNA directly from spiked normal serum with a method using the magnetic-bead method, because not only is the price lower but the protocol is easier and more rapid than the silica membrane based method. Finally, duplex-PCR assay with two primer pairs and hybridization was used with both synthetic LipL32 and 16S rRNA probes. The developed duplex-PCR allowed detection of two products of 279 bp for the LipL32 gene and 430 bp for the 16S rRNA gene. In spiked serum samples artificially seeded with L. interrogans sv. Bratislava, the least density of approximately 106 cells per ml could be analyzed by PCR-Agarose Gel Electrophoresis (AGE) and 10 cells per ml could be analyzed by PCR-Southern Blot Hybridization (SBH). Thus the detection of PCR products by SBH using the fluorescein ULS® labeled LipL32 and 16S rRNA probes and chemiluminescent detection facilitated the detection of low numbers of pathogenic Leptospira in serum samples. Both synthetic DNA probes were also found to be specific for confirmation of PCR products by SBH when using single and combined DNA probes with final detection by chemiluminescence and/or colorimetric. This study provides some guidance in the future for application of this developed molecular technique for detection of pathogenic Leptospira spp. in clinical patient samples. The author suggests comparing different samples collected from patients suspected of having leptospirosis, at different stage of the disease, because using serum samples only may be unsuitable for PCR analysis

Abstract: โรคเลปโตสไปโรซิสเป็นหนึ่งในปัญหาทางสุขภาพของประเทศไทย การตรวจทางห้องปฏิบัติการเพื่อให้การ วินิจฉัยแยกโรคได้ถูกต้องและรวดเร็วจึงมีความสำคัญ เพื่อให้การรักษาผู้ป่วยได้อย่างมีประสิทธิภาพ การศึกษานี้ได้พัฒนา วิธีดูเพล็กซ์-พีซีอาร์-ไฮบริไดเซชัน เพื่อตรวจหาสารพันธุ์กรรมของเชื้อเลปโตสไปราสายพันธุ์ก่อโรคในตัวอย่างซีรัม โดย หาวิธีการสกัดดีเอ็นเอและสภาวะที่เหมาะสมของวิธีดูเพล็กซ์-พีซีอาร์ รวมทั้งการพัฒนาดีเอ็นเอโพรบขึ้นเองสำหรับตรวจ ด้วยวิธีไฮบริไดเซชัน เพื่อให้ได้วิธีการที่มีความไวและความจำเพาะสูง ผลการเปรียบเทียบวิธีการสกัดดีเอ็นเอ 2 วิธี พบว่าวิธีที่ใช้การจับดีเอ็นเอด้วยเม็ดเหล็ก มีประสิทธิภาพใกล้เคียง กับวิธีการที่ใช้เยื่อกรองซิลิกา แต่วิธีแรกมีราคาถูกและขั้นตอนการสกัดง่าย และรวดเร็วกว่าวิธีที่สอง ในการเพิ่มจำนวนยีน เป้าหมายด้วยวิธีดูเพล็กซ์-พีซีอาร์ ด้วยไพร์เมอร์ 2 ชุด Lep1/Lep2 และ Lep3/Lep4 ที่ได้ปรับสภาวะเหมาะสม สามารถ เพิ่มจำนวนยีนเป้าหมายในส่วนของ LipL32 และ 16S rRNA ในปฏิกิริยาเดียวกัน ได้ผลิตผลพีซีอาร์ขนาด 279 และ 430 คู่ เบส ตามลำดับ และในการยืนยันผลิตผลพีซีอาร์โดยวิธี Southern blot hybridization ด้วยโพรบที่สังเคราะห์ขึ้น 2 ชนิด คือ โพรบ LipL32 และ 16S rRNA สามารถตรวจพบความจำเพาะของโพรบทั้งสองเมื่อใช้โพรบทั้งแบบแยกเดี่ยวหรือ แบบผสมรวมกันในปฏิกิริยาไฮบริไดเซชันเดียวกัน การทดสอบหาความไวของวิธีการที่พัฒนากับตัวอย่างซีรัมที่มีการเติมเชื้อสายพันธุ์ก่อโรค L. interrogans sv. Bratislava ผลความไวของวิธีการดูเพล็กซ์-พีซีอาร์ที่วิเคราะห์ผลิตผลด้วยวิธี Agarose gel electrophoresis ได้ที่ปริมาณน้อย ที่สุดที่ความเข้มข้น 106 เซลล์/มิลลิลิตร และด้วยวิธี Southern blot hybridization ที่ความเข้มข้นของเชื้อ 10 เซลล์ ดังนั้นการตรวจผลิตผลของพีซีอาร์โดยวิธี Southern blot hybridization ด้วยโพรบ 2 ชนิดที่สังเคราะห์ ซึ่งทำการติดฉลาก ด้วย fluorescein ULS® และตรวจติดตามด้วยวิธีการเปล่งแสงทางเคมี และการเกิดสี จึงเพิ่มทั้งความไวและความจำเพาะ ของการตรวจ ทำให้สามารถตรวจหาเชื้อเลปโตสไปราที่มีจำนวนน้อยๆ ในตัวอย่างซีรัมได้ ในการจะนำวิธีการที่พัฒนาเพื่อไปใช้ตรวจหาสารพันธุ์กรรมของเชื้อเลปโตสไปราชนิดก่อโรคในสิ่งตรวจทาง คลินิกจากผู้ป่วยในอนาคตนั้น ซีรัมอาจไม่เหมาะสมสำหรับนำมาใช้ตรวจด้วยวิธีพีซีอาร์ ผู้วิจัยจึงเสนอแนะให้ทำการ ทดลองเปรียบเทียบการใช้ตัวอย่างสิ่งตรวจชนิดต่างๆ ที่เก็บจากผู้ป่วยที่สงสัยว่าจะป่วยด้วยโรคเลปโตสไปโรซิส โดยเก็บใน ช่วงเวลาต่างๆ กัน เพื่อให้ได้ตัวอย่างที่เหมาะสมสำหรับนำมาใช้ตรวจด้วยวิธีพีซีอาร์ต่อไป

Mahidol University

Address: NAKHON PATHOM

Email: liwww@mahidol.ac.th

Name: Unchalee Tansuphasiri

Role: Thesis Advisors

Created: 2007

Modified: 2553-06-22

Issued: 2010-06-12

วิทยานิพนธ์/Thesis

application/pdf

CallNumber: TH S959ra 2007

eng

DegreeName: Master of Science

Level: Master's Degree

Descipline: Infectious Diseases and Epidemiology

Grantor: Mahidol University

©copyrights Mahidol University

ลำดับที่.	ชื่อแฟ้มข้อมูล	ขนาดแฟ้มข้อมูล	จำนวนเข้าถึง	วัน-เวลาเข้าถึงล่าสุด
1	4837359.pdf	821.03 KB	21	2026-05-26 18:16:01

ใช้เวลา

0.277946 วินาที